一株尿液标本分离获得Actinotignum schaalii的鉴定及生物学特性分析

李莎，杜晶辉△，商希鹏，刘旭，李瑞仕，蒋建春

Actinotignum schaalii（A.schaalii）是一种兼性厌氧的革兰阳性杆菌，1997年首次报道并被归为放线棒菌属（Actinobaculum），2015 年重新分类并命名为Actinotignum schaalii［1］。随着微生物实验室培养条件的完善以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术的广泛应用，A.schaalii检出率有所增高，且发现其与泌尿系感染密切相关。学者认为A.schaalii为引起尿路感染的新型病原体，值得关注［2］。目前国内尚无关于A. schaalii的任何文献报道。本文报告1 例分离自尿液标本中的A. schaalii，从形态特征、培养特性及鉴定方法等方面进行阐述，为临床诊疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 患者 男，66 岁，汉族，主因急性脑梗死后语言不利、左侧肢体活动不利，于2020年1月19日入院。住院期间出现尿频、排尿困难等泌尿系感染症状。尿常规结果显示：白细胞1+（70 个/μL）、尿胆原2+（66 μmol/L）、尿白细胞计数155.80 个/μL、尿白细胞（高倍视野）28.04 个/HPF、细菌计数2 020.70 个/μL。临床给予经验性用药（口服呋喃妥因肠溶片）并连续3 d 留取尿标本，培养48 h 后进行细菌鉴定。

1.2 主要仪器及试剂 VITEK MS 质谱仪（法国梅里埃公司），CO2培养箱（日本松下公司），哥伦比亚血平板和麦康凯平板（中国百博公司），沙保罗平板（郑州安图公司）。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养 以无菌方法留取的尿液，按照临床检验操作规程（第4 版）接种于哥伦比亚血、麦康凯和沙保罗平板，37 ℃、5%CO2环境下培养24～48 h，观察细菌菌落特征并涂片进行革兰染色，镜下观察细菌形态特点。

1.3.2 细菌鉴定 （1）MALDI-TOF MS 技术鉴定菌株。取1 μL 标本凃于靶板上，加入1 μL CHCA 基质液，待完全干燥后，VITEK MS质谱仪进行鉴定。重复以上操作检测3次。（2）16S rRNA 测序技术鉴定菌株。将菌株分纯培养48 h后送天津金域医学检验实验室，对该菌进行基因组DNA 提取、16S rRNA 扩增、PCR 产物回收及测序，并将测序结果与GenBank数据库中的序列进行比对。

1.3.3 序列比对及系统发育分析 将所得的基因序列提交至GenBank数据库，使用BLAST软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）将所测分离菌的16S rRNA 基因序列与GenBank数据库中的序列进行比对，找到相似度高的几组基因序列并下载，使用MEGA5.2软件构建系统发育树。

2 结果

2.1 分离菌培养及形态特点 在37 ℃、5%CO2环境下培养24 h的哥伦比亚血平板上可见细沙样微小菌落；沙保罗和麦康凯平板上未见菌落生长。培养48 h后哥伦比亚血平板上可见白色、干燥、无溶血环小菌落，见图1。取单个菌落涂片并进行革兰染色，显微镜下为革兰阳性短杆菌，形态不特异，似棒杆菌，见图2。

Fig.1 Bacterial colony of the isolated strain图1 分离菌的菌落形态

Fig.2 Morphology of Gram strain of the isolated bacteria(×1 000)图2 分离菌革兰染色的镜下形态（×1 000）

2.2 分离菌鉴定

2.2.1 MALDI-TOF MS 鉴定结果 VITEK MS 质谱仪重复检测3次，2次结果显示为A.schaalii，质谱峰清晰可见，特征峰鲜明，可信度为99.9%，见图3；1次检测失败，显示波峰数目不足。

2.2.2 16S rRNA 基因测序鉴定结果 测序结果显示分离菌与已知的A.schaalii16S rRNA 基因序列相似度为98.84%，GenBank 登录号为NR116869.1，鉴定为A.schaalii，属于放线棒菌属，为兼性厌氧、革兰阳性杆菌。

2.3 构建系统发育树 MEGA5.2 软件构建的系统发育树显示，该分离菌的系统发育位置与2 株A.schaalii在同一分支上，属于同一种，所以该分离菌为A.schaalii（可信度为100%），见图4。

3 讨论

Fig.3 The mass spectrogram of the isolated strain图3 分离菌的质谱图

Fig.4 Phylogenetic tree of the isolated strain图4 分离菌的系统发育树

3.1A.schaalii的生物学特点A.schaalii属于放线棒菌属，为兼性厌氧菌，营养要求高，需在37 ℃、5%CO2哥伦比亚血平板上培养48 h 才能看到白色、细小、无溶血环的菌落，涂片经革兰染色后可见革兰阳性短杆菌，未见明显菌丝，与常见放线菌形态不同。A.schaalii是人体泌尿系统、皮肤的正常菌群，常规培养生长缓慢甚至不生长，易被生长迅速的需氧菌覆盖而忽视，这也是A.schaalii难以被发现的原因，尤其在尿液标本中。本实验菌株来自一位长期卧床的老年脑梗死患者，入院治疗1 个月间长期卧床，存在泌尿系感染风险。当患者表现出排尿频繁、尿潴留时，尿常规检查显示白细胞和细菌数量增多，支持尿路感染。连续3 d采集尿液进行培养并检测，第1 次检出魏氏柠檬酸杆菌，第2、3 次均检出纯的A. schaalii。连续2 d 留取的尿标本均培养出纯的A.schaalii，故可以排除污染的可能，提示A.schaalii为致病菌。第1 次尿检结果只检出魏氏柠檬酸杆菌，可能由于A.schaalii培养24 h 菌落生长不明显，且被魏氏柠檬酸杆菌菌落覆盖而被忽视。

3.2 MALDI-TOF MS 和16S rRNA 基因测序技术可用于A.schaalii的鉴定 该实验菌株经VITEK MS质谱仪鉴定为A.schaalii，故选用16S rRNA基因测序技术进行确认，测序结果与GenBank 数据库中的序列进行比对，显示该菌与已知的A. schaalii16S rRNA基因序列相似度为98.84%，登录号为NR116869.1，鉴定为A.schaalii，提示MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序可用于A. schaalii的鉴定。Prigent 等［3］回顾 分 析 2004 年 7 月 —2015 年 2 月 间 检 测 出A. schaalii的情况，并评估 MALDI-TOF MS 在检出A. schaalii中发挥的作用，结果显示自 2011 年 11 月质谱技术应用于实验室以来，A.schaalii检出数量明显增加，且与测序鉴定结果一致。相较于16S rRNA基因测序技术，MALDI-TOF MS 能够准确、快速、低成本地鉴定A.schaalii，得到临床实验室广泛应用。而通过生化反应鉴定细菌的方法，如API系统、Vitek鉴定系统无法鉴定A.schaalii，因为这些系统中没有相关数据。直至2015 年Vitek ANC 卡数据更新后，才使得A.schaalii有可能通过生化反应得到鉴定，但是该数据库尚不完善，鉴定结果会出现差异，本实验室用Vitek ANC 卡进行鉴定，鉴定结果为龋齿放线菌。因此，MALDI-TOF MS 技术仍是该菌常规鉴定的首选技术。

3.3A. schaalii为新型尿路感染病原菌 随着MALDI-TOF MS 技术的广泛应用，A.schaalii检出率日益提高，且有研究发现该菌与泌尿系感染密切相关，认为该菌为新型的泌尿系感染致病菌。Lotte等［2］汇总分析了与A. schaalii感染有关的 172 例患者，其中121例与尿路感染有关，且大多数平均年龄大于60 岁；儿童也有较高的感染A.schaalii的风险，迄今为止共报道了7 例（8 个月至16 岁的儿童）。Bank 等［4］的一项丹麦全国数据分析得到相似结果：A. schaalii感染风险最高的年龄组为≥55 岁组［10.9例/（百万·年）］，以男性患者为主，且多有泌尿系感染的危险因素。此外，Lotte 等［5］还对 50 例检测出A.schaalii的患者进行了为期3 年的前瞻性研究，发现有27 例的感染与A.schaalii有关，且其中14 例为泌尿系感染。关于A.schaalii的研究我国尚无相关文献报道，本文为我国首次报告。

3.4A.schaalii感染的临床治疗方案 目前尚无关于A.schaalii感染的治疗指南。Lotte等［2］指出，虽然氟喹诺酮类和复方新诺明类药物广泛用于治疗泌尿系感染，但不推荐用于治疗A.schaalii引起的泌尿系感染，因为A.schaalii对复方新诺明和二代喹诺酮类耐药率高；但大多数菌株仍然对新型氟喹诺酮类药物（左氧氟沙星、莫西沙星）敏感，对β-内酰胺类、四环素类、万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、利福平、呋喃妥因、庆大霉素等药物也敏感；最有效的、值得推广的治疗方法是β-内酰胺类抗生素连续使用2 周。虽然治疗的最佳时间尚未确定，但根据感染部位的不同，治疗应该持续2 周或更长时间。本例患者在接受经验性抗生素治疗（口服呋喃妥因肠溶片3 d）后，泌尿系感染症状好转，提示治疗有效。如何快速、有效治疗A.schaalii引起的泌尿系感染，尚需搜集更多临床数据进行相关药敏试验。

综上所述，A.schaalii为兼性厌氧的革兰阳性放线棒菌，生长极其缓慢，易引起老年人泌尿系感染，为新型尿路感染致病菌。MALDI-TOF MS技术能够准确、快速地鉴定该菌。当尿标本直接镜检可见革兰阳性短杆菌，但培养阴性，且无明显诱因的尿路感染复发时，临床医生应当考虑A. schaalii感染的可能，厌氧环境下或加5%CO2培养48 h 后鉴定。对于A.schaalii引起的尿路感染，尚无临床治疗指南，目前最有效的、值得推广的治疗方法是β 内酰胺类抗生素连续使用2周。