复合藻通过调节Stir3 改善线粒体能量平衡抑制紫外线诱导的皮肤光老化

张 松，党学良，石 磊，文一丁*

(1.成都丁因生物科技有限公司，四川 成都，610000)

皮肤光老化(skin photoaging)是由于皮肤长期受到日光照射所引起的损害，是自然老化和紫外线辐射共同作用的结果。表现为皮肤曝光部位粗糙、增厚、干燥，皮肤松弛、皱纹加深加粗，局部有过度的色素沉着或毛细血管扩张，严重可发展为各种良性或恶性肿瘤(如日光角化病、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤等)[1-2]。现代医学对皮肤光老化发病机理已取得了一定成果。关于光老化发病机理有基质异常降解、免疫抑制、自由基及线粒体突变学说等[3]。目前研究认为皮肤光老化主要与紫外线波长、照射时间、照射剂量以及生理、病理、职业和环境因素相关；紫外线照射皮肤可增加细胞内活性氧（ROS），被认为是导致衰老的最重要因素；紫外线B（UVB）会破坏体内氧化还原稳态，从而导致细胞氧化还原过程失调[4-5]。当ROS定位于线粒体，可损害线粒体的基本功能，导致线粒体损伤[6-7]。线粒体是细胞能量的产生器，当线粒体损伤发生时，可导致细胞能量平衡紊乱，继而加剧细胞损伤的发生[8]。

从中医机理上来讲，日为阳，月为阴，日光的性质属阳热[9]。日光中紫外线，在中医中属于光毒，“光毒”为毒邪之一，为日光所引起，是诱发皮肤光老化的主要外感因素。《洞天奥旨》“日晒疮，乃夏天曝烈之日曝而成者也，必先疼而后破，乃外热所伤，非内热所损也”，形象描述了光毒致病的特点[6]。海藻属于咸寒之品，有清热化痰,软坚散结,利水消肿之功效。

海藻分为绿藻、红藻和褐藻，常见的褐藻如海带、马尾藻、泡叶藻、巨藻等。褐藻多含褐藻糖胶、甘露醇、褐藻酸、褐藻淀粉和等主要化学成分粗蛋白、甘露醇、灰分、无机成分成分[10-12]。褐藻糖胶含有相当数量的岩藻糖和硫酸基多糖及少量的半乳糖、木糖、甘露糖和糖醛酸等。现代药理学研究发现，海藻提取物具有抗氧化、抗菌抗炎及影响胶原蛋白代谢改善和提高皮肤状态等的作用。鼠尾藻、羊栖菜和海带提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有一定抑制作用[13-14]。而褐藻中低分子量多糖显示出极好的水分吸收和保湿能力。本研究前期研发一种复合藻由褐藻（海带、墨角藻、巨藻）及小球藻已适宜的比例组成，本研究将就该复合藻提取物在防护皮肤光损伤及皮肤衰老的作用及机制开展相关研究。

1 材料及仪器

1.1 材 料

复合藻提取物[褐藻（海带、墨角藻、巨藻）及小球藻混合组成，成都丁因科技有限公司]；Sirt3抗体（abcom，美国）；Nrf2抗体（abcom，美国），GAPDH 抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；NAD/NADPH检测试剂盒，线粒体提取试剂盒均购自江苏碧云天生物技术研究所。其他试剂均为国产分析纯。人上皮细胞购自湖南丰晖生物技术公司。

1.2 仪 器

二氧化碳培养箱(Sigma，公司)；生物洁净工作台(苏州安泰空气有限公司)；多功能酶标仪（Tecan Mpro200，瑞士），Western blot电泳及化学成像系统（Bio-red，美国）

2 方 法

2.1 细胞培养及分组给药干预

UVB诱导人上皮细胞（Hacat）衰老模型的建立，Hacat细胞接种至6孔板培养过夜后，吸除培养基，PBS洗1次，加100μL PBS于培养孔中，以UV-100手提式紫外灯（波长302nm，辐照强度120～130μW／cm2）在间距20cm处照射。照射完毕后吸除PBS，换以新鲜培养基继续培养。实验照射剂量为100mJ／cm2，照射时间分别为800s，药物干预组为模型建立前先给与复合藻提取物干预，复合藻提取物给药计量分别为5、25、50μM，给药干预12h后建立模型。

2.2 MTT 法检测细胞活力

将Hacat细胞以5×104个/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后分别加入不同浓度的复合藻提取物干预，每孔200μL，每个浓度设5个复孔，复合藻提取物与细胞共培养12h后，不同时间点下建立UVB诱导照射模型，模型建立完成后向每孔中加入5g/L的MTT 20μL继续培养 4h，弃上清液，向每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)100μL 溶解结晶体，置于摇床振荡10 min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪570 nm波长处测定每孔吸光度值(A)，实验重复3次。

2.3 ROS 染色

将Hacat细胞与二氢乙醚（DHE）在37℃下孵育30分钟，并在冷PBS中洗涤两次以去除多余的DHE。建立模型后用PBS冲洗Hacat，用10μM DHE在DMEM中处理30m in。取出培养基，用PBS清洗Hacat两次。使用荧光显微镜（Olympus IX53，Olympus，Tokyo，Japan）和FITC滤波器在激发波长519nm和发射波长590nm处测量荧光。

2.4 分离提取线粒体、细胞浆

按照试剂盒方法，用细胞刮收集 5×107个细胞，预冷 PBS 冲洗，4°C 下，600g 离心5min；弃上清，加入 1mL 线粒体提取液，并加入蛋白酶抑制剂，置于冰上孵育 10min；转移细胞悬液到已预冷的 Dounce 匀浆器中，研磨。4°C 离心10 min；取上清液，4°C，17000 g 离心 20 min；收集上清液的细胞浆部分，将沉淀保存于线粒体储存液中；BCA蛋白定量，样品于-20℃保存。

2.5 细胞中ATP/ADP，NAD+/NADPH 检测

高效液相色谱(high performance liquidchromatography,HPLC)法检测细胞内的腺苷酸，收集细胞，匀浆,收集到1.5 mL EP管中,离心去除上清,加入200 μL高氯酸于冰上处理组织匀浆液45 min; 4°C 12 000 r/min离心取上清,经过0.22μm微孔滤膜过滤后通过HPLC检测ATP、ADP含量。按照试剂盒说明书检测细胞中NAD/NADPH比值，试剂盒购自碧云天

2.6 线粒体复合物I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性的检测

采用紫外分光光度法测定线粒体复合物活性，操作步骤按线粒体复合物定量检测试剂盒产品说明书进行。复合物I～ Ⅳ的活性测定分别以每分钟每mg 蛋白中利用的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH; 美国GENMED公司，GMS50007)、二氯酚靛酚(diohloroindophenol，DCP; 美国GENMED 公司，GMS50008)、还原型泛醌(Reduced form of ubiquinone，CoQH2; 美国GENMED公司，GMS50009) 及还原型细胞色素C(Reduced cytochrome C，cyto C; 美国GENMED 公司，GMS50010)的检测值表示(μmol) 。

2.7 细胞中细胞色素C 的检测

按照细胞色素C检测试剂盒方法进行，所有检测指标均进行标准曲线的建立,样品吸光度(A)值根据标准曲线计算浓度。

2.8 Western blot 检测线粒体中Sirt3，Nrf2 蛋白检测

取各组细胞，加裂解液，离心后吸取上清液，Bradford 法测定蛋白质浓度。各标本取50 μg，上样，SDS-PAGE 电泳，蛋白转至PVDF 膜，封闭液室温封闭后分别加入一抗和二抗，一抗为Sirt3，Nrf2，GAPDH (1：1000)，加入ECL 试剂，暗室曝光，显影、定影。电泳成像系统定量扫描分析，结果以GAPDH 校正。

2.9 统计分析

应用SPSS 18.0 软件进行统计学分析，组间多组数据比较采用单因素方法分析，组内数据比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 复合藻提取物抑制UVB 引起的细胞活力降低

实验结果表明，不同照射时间下UVB可以导致人Hacat细胞活力显著降低，其中600s，800s下降显著与模型组具有统计学差异（P＜0.05），当给予复合藻提取物干预后，人Hacat细胞活力显著升高且与模型组具有统计学差异（P＜0.05），此外不同剂量复合藻提取物干预组中，细胞活力在中剂量及高剂量组间具有统计学差异（P＜0.05）。见图1.

3.2 复合藻提取物抑制UVB 引起的ROS 生成

染色结果表明，UVB可以导致人Hacat细胞中ROS显著升高，细胞具有显著的红色亮染，当给予复合藻提取物干预后，人Hacat细胞中ROS显著减少且具有浓度依赖性。见图2.

3.3 复合藻提取物抑制UVB 引起的细胞能量代谢紊乱

细胞功能紊乱的关键因素是能量代谢异常，实验结果表明，UVB可以显著降低人Hacat细胞中ATP/ADP比值，减少细胞能量代谢，而给与细胞复合藻提取物干预后，细胞ATP含量显著升高，ATP/ADP比值与模型组具有统计学差异（P＜0.05）。同时UVB还可以明显降低细胞NAD/NADH含量，而给与细胞复合藻提取物干预后可明显升高细胞NAD/ NADH含量，中，高剂量组与模型组具有统计学差异（P＜0.05）。见图3.

3.4 复合藻提取物抑制UVB 引起的细胞线粒体复合物活性降低

图1 复合藻对细胞活力的影响

图2 褐藻提取物干预对UVB 引起的ROS 生成的影响

图3 复合藻提取物对ATP/ADP 及NAD/NADH 的影响（*P＜0.05 vs control; P＜0.05 vs Model）

图4 复合藻提取物对线粒体复合物I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性的影响（*P＜0.05 vs control; P＜0.05 vs Model）

线粒体复合物是线粒体能量代谢的关键物质，实验结果表明，UVB可以导致细胞线粒体复合物I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性显著降低，与正常组具有统计学差异（P＜0.05），而给予复合藻提取物干预后，细胞线粒体复合物活性显著升高，其他高剂量组对线粒体复合物I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均具有显著升高作用，且与模型组具有统计学差异（P＜0.05）。见图4

3.5 复合藻提取物抑制UVB 引起的细胞外细胞色素C 升高

辐射可以导致线粒体损伤继而释放细胞色素C，实验结果表明，UVB照射后细胞胞浆中细胞色素C含量显著升高，与正常组间具有统计学差异（P＜0.05），而给与复合藻提取物干预后，胞浆中细胞色素C含量显著降低，与模型组具有统计学差异（P＜0.05）。见图5.

3.6 复合藻提取物抑制升高线粒体中Sirt3，Nrf2蛋白表达

图5 复合藻提取物对线粒体细胞外细胞色素C 的影响（*P＜0.05 vs control; P＜0.05 vs Model）

图6 复合藻提取物对Sirt3 及Nrf2 蛋白表达的影响（*P＜0.05 vs control; P＜0.05 vs Model）

蛋白实验结果表明，UVB可以显著抑制细胞中Sirt3蛋白及Nrf2的表达，而给予复合藻提取物后，可以明显升高Sirt3及Nrf2蛋白的表达，且具有浓度依赖性，与模型组具有统计学差异。见图6.

4 讨 论

皮肤老化是一种复杂的、渐进的生物学现象，老化与年龄和光老化有关。研究发现与年龄相关的生长因子反应减弱，降解细胞外基质，胶原分子表达减少，前胶原活性中断等因素均在光老化皮肤中被观察到，该结果表明时间老化和光老化具有共同机制[15]。紫外线照射是导致皮肤外在老化的主要原因，其特点是严重的皮肤色素沉着、下垂和起皱[16]。紫外线照射增加细胞内活性氧（ROS）的产生被认为是衰老的最重要因素。因此开发有效的抗光老化策略对于降低紫外线B（UVB）辐射的风险，保护皮肤具有重要作用。

线粒体是维持细胞正常功能的关键细胞器，细胞氧化磷酸化反应在线粒体中进行，产生ATP为细胞供应能量，因此线粒体又被称为细胞的“能量工厂”。线粒体功能及正常的能量代谢是维持细胞正常功能的关键，UVB照射可导致皮肤细胞中ROS的产生及聚集，继而导致线粒体损伤的发生[17]。皮肤在紫外辐射下，活性氧自由基大量产生，打破氧化和清除的平衡，导致多种形式的组织损伤，特别是氧化应激反应导致线粒体功能损伤，继而导致线粒体能量代谢紊乱发生。本研究结果表明，UVB照射可以显著抑制人上皮细胞的活力，降低细胞中ATP/ADP含量，明显抑制线粒体能量代谢水平，同时显著降低NAD/NADH含量。NAD/NADH是机体中重要能量代谢酶，同时参与细胞氧化还原状态，NAD/NADH的水平直接影响着细胞的节律、衰老、癌变。NAD在细胞抗氧化中具有重要作用[18]。实验结果表明，UVB可以显著降低人上皮细胞中NAD/NADH的含量。UVB还可以显著抑制细胞线粒体中的复合物活性，而线粒体复合物是维持线粒体三羧酸循环，产生能量的关键酶。此外UVB损伤还导致线粒体细胞色素C的外泄，导致胞浆中细胞色素C显著升高。

海藻的主要活性成分可分为6大类，即酮类化合物、萜烯类、多肽、生物碱、莽草酸类和多糖类化合物[19]。本研究发现褐藻提取物干预后可显著改善人上皮细胞线粒体损伤的发生，恢复线粒体能量代谢，减少ROS的生成，同时恢复线粒体复合物活性，减少细胞色素C的外泄。

氧化应激在辐射性损伤具有重要作用，线粒体参与其中。氧化应激可以显著影响线粒体蛋白的乙酰化状态。Sirtuins属于组蛋白去乙酰化酶，SIRT-3、SIRT-4和SIRT-5是线粒体中主要存在的去乙酰化酶[20]。其中SIRT3具有强大的去乙酰化活性并控制近80-90%的线粒体蛋白质乙酰化状态。近年的研究发现Sirt 3 处于线粒体代谢的中心调节位置。Sirt 3可通过调节线粒体中ATP生成有关酶去乙酰化，从而发挥线粒体能量调节作用，影响线粒体ATP的生成，Sirt 3能使电子传递链复合物I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ去乙酰化，提高复合物I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性[21-22]。此外Sirt2还可激活机体抗氧化关键蛋白Nrf2，抑制机体过度的氧化应激反应。因此该酶又被称为维持人体生命青春的关键蛋白。本研究发现褐藻提取物干预人上皮细胞后，可以显著升高由于UVB导致的Sirt 3表达降低，升高细胞中Sirt 3含量，且可激活Nrf2。因此，本研究中的复合藻提取物抑制紫外线诱导的皮肤光老化的分子机制是通过调节Sirt 3来影响线粒体功能，继而恢复线粒体能量供应；其调控下游线粒体功能的机制还有待进一步探究。