解淀粉芽孢杆菌鉴定、育种及其抗细菌活性研究进展

潘林1，王卿惠，王世伟1，李波1，朱研文1，卢思帆1，周子强1

解淀粉芽孢杆菌鉴定、育种及其抗细菌活性研究进展

潘林1，2，王卿惠3，王世伟1，2，李波1，2，朱研文1，2，卢思帆1，2，周子强1，2

（齐齐哈尔大学 1. 生命科学与农林学院，2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3. 东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

解淀粉芽孢杆菌可作为微生物杀菌剂，能产生多种抗菌活性物质，杀菌谱广；对病原菌具有防治作用，可防治作物、蔬菜、瓜果病害，使用该杀菌剂有助于减少化学农药，保证食品安全．对解淀粉芽孢杆菌的分离、鉴定及其抗细菌活性的研究进展进行了综述，为解淀粉芽孢杆菌抗细菌活性物质的开发和利用奠定基础．

解淀粉芽孢杆菌；鉴定；育种；抗细菌活性

解淀粉芽孢杆菌（）具有广泛抗菌能力，在种植业、养殖业、果蔬采后病害防治、环保方面具有广泛的应用前景[1]．作为一种良好的益生菌，广泛应用于动植物病原真菌和细菌的防治；作为生物农药，具有日趋取代传统化学农药的趋势[2-3]．解淀粉芽孢杆菌自身的生长过程中能产生多种抗菌物质，包括抗菌蛋白、脂肽类和聚酮化合物等．其中抗菌脂肽在植物病害防控上发挥重要作用，具有绿色、安全、高效等优势[4]．抗菌蛋白是一类对植物病原菌具有强烈抑制作用的活性蛋白，由于其抑菌机制特殊，不易产生抗性，对人体与环境不会造成危害[5-6]．尽管目前解淀粉芽孢杆菌分类、鉴定、抗菌物质、抗菌机理以及与植物互作的研究已经逐渐深入，但是解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定、抗细菌，特别是致病性细菌的研究还比较少，因此深入研究其抗细菌的种类和机制对解淀粉芽孢杆菌应用具有重要意义．解淀粉芽孢杆菌的新菌株分离、鉴定及抗细菌作用的机理研究将使其更广泛、大规模地应用于工农业、医药卫生及食品加工业等重要领域．

1　解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定与育种

1.1　解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定

解淀粉芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌（）亲缘性很高的细菌，分布极其广泛，具有多样性功能．

解淀粉芽孢杆菌可以分离于各种土壤（包括菜园土壤）、动植物体内、海水等环境．多采用平板对峙法进行初筛，双层平板法进行复筛（如B11），通过抑菌带判断其抗菌活性，通过菌株生理生化特征和其分子生物学手段对其加以鉴定（见表1）．如K6菌株分离于菜园土壤，具广谱抗菌活性，对细菌、霉菌、酵母菌均具抑制作用．但K6菌株对G+菌抑制作用最强，对霉菌抑制相对较弱，该菌对不同微生物具有不同抑制作用．FKB-1菌株分离于阜康市食用菌栽培基，对绿色木霉菌（）抑制效果稳定，是一株优良抗木霉菌生防菌．从鲫鱼肠道中分离的JX001菌株对嗜水气单胞菌（）抑制作用较强，能防止养殖水中嗜水气单胞菌暴发，促进水产养殖业的发展．并能产生大量蛋白酶，可用于蛋白质饲料降解．分离于连云港海域海水的GM-1菌株经自发突变获得GM-1-2，能明显抑制白色念珠菌（）生长．可见，分离到优良的菌株是进一步研究解淀粉芽孢杆菌的关键，为下一步进行培养、条件优化和其它功能研究奠定了基础．

表1　解淀粉芽孢杆菌的分离和鉴定

1.2　解淀粉芽孢杆菌的育种

育种是获得优良菌株的重要手段．在解淀粉芽孢杆菌的育种工作中，可以采用自发突变和人工诱变，通过选育不仅能提高解淀粉芽孢杆菌的生防效果，也可提高生物转化能力．汪晶晶[12]等为了阐明GM-l自发突变菌株变异与抗菌活性的关系，采用形态学观察、生理生化实验及16S rDNA和gyrB基因序列对自发突变（GM-1-2）进行了分析．使用8种植物病菌为供试菌，采用平板对峙和牛津杯法检验GM-1-2菌株及其发酵液抑菌作用；采用硫酸铵沉淀法初步分析了其产生的抑菌物质．结果发现，GM-l-2与GM-1菌落形态、颜色、菌体大小不但无明显差异，而且生理生化特性、16S rDNA和gyrB序列也相同．但GM-1-2菌种对小麦根腐病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、大豆菌核病菌、小麦雪腐病菌、甘蓝枯萎病菌、斑点落叶病菌、黄瓜枯萎病菌的菌丝生长抑制明显高于原始出发菌株GM-1．抑菌带宽度提高了0.2~9.0 mm，无菌发酵液抑制率提高了1.1%~153.7%．抑菌物质存在于硫酸铵沉淀中．可见，抑菌作用与菌体形态、16S rDNA和gyrB序列并无确切的相关性，推测可能是自发突变使其基因组其它基因发生变异而使抗性基因受到影响，或抗性基因发生突变，而使抗性特性得以提高的结果，具体的抑菌机制尚有待阐明．

诱变育种在菌种选育中具有重要意义．解淀粉芽孢杆菌的诱变可以增加次生代谢产物的含量，提高抗菌活力．解淀粉芽孢杆菌BI2能产生N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG），选用等离子体和紫外双重复合诱变，筛选到的BH-3-2菌株较出发菌株NAG产量提高4倍．3-羟基丁酮作为一种重要的食用香料和平台化合物被广泛应用于医药、食品等领域．采用常压室温等离子体（ARTP）和60Co射线复合诱变，获得高产3-羟基丁酮突变株H-5（68.2 g/L）．5 L发酵罐培养优化后于30 L发酵罐放大培养，最终3-羟基丁酮产量较出发菌株提高26.8%．胡萝卜软腐欧文氏菌（sub sp. carotovora，Ecc）能引起细菌性软腐病，是采后蔬菜腐败的因素，BGP20对该病害具有较好的生防效果．在200~800 Gy剂量范围内，60Co对BGP20的致死率随着辐照剂量增加而上升；600 Gy剂量60Co辐照致死率为78.3％．选用该剂量进行诱变选育，利用辣椒（L.）对409株突变菌株进行生防效果活体评价，发现突变菌株BGP20-1生防效果显著提高（见表２）．可见，复合诱变在育种工作中起到了重要作用，在育种中应该发挥其优势．

表2　解淀粉芽孢杆菌的诱变

2　解淀粉芽孢杆菌抗细菌作用研究

解淀粉芽孢杆菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，具有广泛抗菌能力．在种植业、养殖业、果蔬采后病害防治、环保和食品安全等领域已具有广泛应用前景．目前解淀粉芽孢杆菌分类、鉴定、抗菌物质、抗菌机理以及与诱导植物产生对病原菌的系统性研究已经逐渐深入，解淀粉芽孢杆菌产生的生物活性物质具有很强的抗细菌活性．研究发现其不但能对一些杆菌、球菌具有抗性，而且对单胞菌、蓝细菌等多种细菌具有抗性，因此具有极好的应用价值．同时，某些同一菌株能对多种细菌产生抗性，即有多效抗细菌活性．深入研究其产生的抗细菌化合物以及抗细菌机制具有重要意义．

2.1　解淀粉芽孢杆菌抗杆菌活性研究

解淀粉芽孢杆菌产生的生物活性物质对杆菌具有较强抗性．Song[16]等发现淀粉芽孢杆菌anti-CA产生的脂肽6-2能破坏生物膜形成细菌（绿浓杆菌PAO1）完整细胞和原生质体，对蜡样芽孢杆菌（）也有抗性．在绿脓杆菌（）PAO1内与胞外多糖相关的PslC基因表达明显受到抑制．Chi[17]等发现解淀粉芽孢杆菌R3产生的生物活性物质能抗大肠杆菌（）．这些活性物质本质上是生物表面活性素（F1，F2，F3，F4，F5），具有氨基酸（GLLVDLL）和羟基脂肪酸（碳长度为12~15），具有广谱抗细菌活性，对多药物抗性病原大肠杆菌具有抗性．经F1处理后，2#全细胞和原生质体细胞膜均受到损伤，整个细菌细胞破粹．可见，解淀粉芽孢杆菌对细菌的抗菌物质，包括脂肽类化合物和表面活性剂，能抑制杆菌相关基因表达或破坏杆菌细胞膜，杀死杆菌细胞．

2.2　解淀粉芽孢杆菌抗球菌活性研究

解淀粉芽孢杆菌产生的生物活性物质对不同的球菌也具有抗性．Jeyanthi[18]等发现解淀粉芽孢杆菌MHB1生物活性物质对抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（）（MRSA）具有抗性．其活性成分具有酚特性，分子量为507Da，能改变MRSA细菌内超微结构而抑制其生长．Gowrishankar[19]发现解淀粉芽孢杆菌MMS-50产生的活性成分（AF）主要为Cyclo（L-leucyl-L-prolyl）．该活性物质能减弱链球菌黏附力、产酸和耐酸能力、葡聚糖合成能力、生物膜形成能力和细胞表面疏水性，从而抑制链球菌引起的龋齿危害；MMS-50 AF也具有抗生物膜和抗毒活性，能明显减少毒力基因的表达．解淀粉芽孢杆菌AP183有机活性物质为一种新型大环多烯类抗生素bacillusin A（1）．Ravu[20]等通过核磁共振和质谱分析，确定该物质是一种新型大环内二酯，对抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌和抗万古霉素屎肠球菌（）均具有抗性．Arguelles Arias[21]等对解淀粉芽孢杆菌GA1部分基因组进行了测序，鉴定了专门用于新羊毛硫细菌素amylolysin合成的基因簇aml．纯化的amylolysin对抗新青霉素的金黄色葡萄球菌具有明显抗性．Regmi[22]等从发酵食品（kimchi）分离出与解淀粉芽孢杆菌FZB42（T）同源性达99.79%的菌株．该菌产生的抗微生物肽（CSpK14）与-内酰胺类药物配合能有效抑制抗万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）和肠球菌（VRE）．CSpK14摩尔质量为4.6 kDa，其N-端氨基酸序列为H-Y-D-P-G-D-D-S-G-N-T-G，与已报导的多肽几乎无同源性．但与来自不同微生物的alpha-2-巨球蛋白和配体门控通道蛋白具有某种程度的一致性．可见，解淀粉芽孢杆菌产生的抗球菌活性物质具有明显的多样性，不但对耐药性球菌具有明显抗性，而且能与其它已有药物组合增强其药物疗效，是新药开发重要资源．

2.3　解淀粉芽孢杆菌抗黄单胞菌和蓝细菌活性研究

细菌凋萎病和细菌叶斑病由水稻黄单胞菌（pv. oryzae，Xoo）、稻旁叶螨和禾薭引起．Wu[23]等使用荧光、扫描电镜、投射电镜揭示解淀粉芽孢杆菌FZB42产生的地非西丁和杆菌溶素能引起黄单胞菌（简称Xoo）细胞壁和细胞结构发生变化，使单胞菌毒力、细胞分裂、蛋白质、细胞壁合成等基因表达明显下调，从而抑制水稻凋萎病和细菌叶斑病发生．在水稻的抗病方面具有应用潜力．赤潮由大规模的独特藻类和蓝细菌（）引起，属世界性严重环境问题．Wu[24]等还发现菌株FZB42可用于防治蓝藻（蓝细菌），对铜绿微囊藻（）、淡水藻类杀灭率达98.78%．抗蓝细菌物质的合成不依于脂肽和聚酮非核糖体合成时所必需的Sfp酶，但与杆菌溶素sfp-i非依赖型合成所用的基因簇有关．杆菌溶素（Bacilysin）能引起海藻细胞壁和细胞器膜显著变化，导致细胞溶解．FZB42产生杆菌溶素可作为蓝细菌防控药剂，减轻水华引起的环保环境危害．

解淀粉芽孢杆菌产生的部分抗细菌活性物质及其抗菌机理见表3．由表3可见，解淀粉芽孢杆菌抗细菌活性物多种多样，其所抗细菌也具有多样性，包括杆菌、球菌和蓝细菌等．其抗菌机理也是多方面的，包括破坏不同层次细菌的结构，改变细胞的功能特性以及抑制相关基因的表达．研究解淀粉芽孢杆菌产生的活性物及其抗菌机理具有重要意义．

表3　解淀粉芽孢杆菌活性物质与抗细菌机理

2.4　解淀粉芽孢杆菌多效抗细菌活性研究

Xu[25]等研究发现，解淀粉芽孢杆菌M1产生的脂肽对多种抗药性弧菌（Vibrio）及希瓦氏菌（）具有抗性．其产生的脂肽N3是主要活性物质，包含表面活性剂同系物，带有氨基酸（GLLVDLL）和羟基脂肪酸（碳链长度12~15）．研究发现，脂肽N3对海水希瓦氏菌和9种弧菌均具有抗性，M1产生脂肽有广谱抗菌作用，对多药物抗性植物病原性弧菌有较强抗性．用脂肽N3处理后，海水希瓦氏菌细胞膜受损，整个细菌细胞破裂死亡．硫醚抗生素是热稳定性多肽，存在硫醚氨基酸、羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸，能抑制单核细胞增多性李司忒氏菌（）、金黄色葡萄球菌（）、蜡状芽孢杆菌（）等多种革兰氏阳性细菌生长．Arguelles Arias[26]等研究发现，解淀粉芽孢杆菌GA1能产生一种抗微生物肽amylolysin，能抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌．根据GA1基因组特征推测，其含有羊毛硫细菌素基因簇（结构基因（A）、修饰基因（M）、运输基因（T）、调节基因（KR）和免疫基因（FE））．A基因破坏导致amylolysin活性损失，说明该基因簇与amylolysin合成有关．基质辅助激光解吸电离飞行和液质联用分析说明amylolysin是一种迄今没有描述过的新羊毛硫细菌素，肽属于羊毛硫细菌素B族．可见，合理利用解淀粉芽孢杆菌的多功能抗细菌活性，不仅能为其作用机理的研究提供数据，而且也能为寻找新的多功能抗细菌类药物开辟新渠道．

解淀粉芽孢杆菌广泛存在于自然界．它不但对多种微生物包括真菌、细菌及病毒产生抑制作用，而且能产生重要的代谢酶类．在动植物病害防治、促生、定殖、益生等多方面具有广阔的应用前景．但一直以来关于解淀粉芽孢杆菌对细菌的抗性研究要比对抗真菌的研究相对较少．随着蛋白质组学和基因组学在该领域的应用，解淀粉芽孢杆菌抗细菌作用机制的研究，抗细菌活性物质以及其合成基因和调节基因功能的研究必将逐渐深入．解淀粉芽孢杆菌抗细菌机理的阐明，将使解淀粉芽孢杆菌在动植物病虫害的防治、生物转化、生物肥的研制和开发领域得到更好的应用．

3　展望

解淀粉芽孢杆菌是不同于枯草芽孢杆菌的芽孢杆菌属中的具有重要研究和应用价值的一个安全菌种．随着分子生物学鉴定技术的发展，已经有越来越多的菌株得以鉴定和应用．分子标记技术（如16 S DNA基因标记）能快速鉴定它与枯草芽孢杆菌的区别，但为了更准确鉴定该菌，采用全基因组测序技术是非常快速有效的方法．对该菌准确地鉴定是研究其抗细菌活性物与抗细菌机理的基础．随着该菌抗细菌活性物的多样性以及抗细菌机理的深入研究，该菌在植物细菌病的防治、医疗保健以及环境保护方面的安全应用必将更加广泛，将创造更大的经济效益和社会效益．

[1] Theresa Lee，Dami Park，Kihyun Kim，et al．Characterization of Bacillus amyloliquefaciens DA12 Showing Potent Antifun-gal Activity against MycotoxigenicSpecies[J]．Plant Pathology Journal，2017，33（5）：499-507

[2] Tan S，Dong Y，Liao H，et al．Antagonistic bacterium Bacillus amyloliquefaciens induces resistance and controls the bacterial wilt of tomato[J]．Pest Management Science，2013，69（11）：1245-1252

[3] Zhao P C，Quan C S，Wang Y G，et al．Bacillus amyloliquefaciens Q-426 as a potential biocontrol agent againstsp spinaciae[J]．Journal of Basic Microbiology，2014，54（5）：448-456

[4] Xie F，Zhu T，Zhang F，et al．Usings for remediation of aquaculture water[J]．Springerplus，2013，2（1）：119

[5] Yang T W，Rao Z M，Zhang X，et al．Fermentation of biodiesel-derived glycerol bys：effects of co-substrates on 2，3-butanediol production[J]．Applied Microbiology & Biotechnology，2013，97（17）：7651-7658

[6] Ding L，Zhang S，Guo W，et al．Exogenous Indole Regulates Lipopeptide Biosynthesis in AntarcticPc3[J]．J Microbiol Biotechnol，2018，28（5）：784-795

[7] 司世飞，宋莉莎，任静，等．一株抗烟草赤星病解淀粉芽孢杆菌的筛选及鉴定[J]．河北大学学报：自然科学版，2018，38（4）：410-415

[8] 杨胜远，韦锦，李云，等．一株产抗菌活性物质解淀粉芽孢杆菌的筛选及鉴定[J]．食品科学，2010，31（21）：208-212

[9] 努尔孜亚，管建华，贾培松，等．一株抗木霉菌解淀粉芽孢杆菌的筛选与鉴定[J]．新疆农业科学，2016，53（7）：1297-1302

[10] 朱芝秀，蒋新华，邓舜洲，等．解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其对嗜水气单胞菌抑制作用研究[J]．中国畜牧兽医，2015，42（3）：734-740

[11] 汪晶晶，曹雪梅，李欢，等．抗菌海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1-2菌株摇瓶发酵培养基和发酵条件优化[J]．江苏农业科学，2018，46（8）：291-295

[12] 汪晶晶，王琦，王军强，等．海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1变异菌株的特性及其抑菌作用研究[J]．河南农业科学，2016，45（11）：65-70

[13] 黎恒，张琳，陈红爽，等．紫外线等离子体复合诱变解淀粉芽孢杆菌提高NAG产量[J]．食品研究与开发，2018，39（12）：172-176

[14] 王诗卉，罗秋玲，刘佳，等．高产3-羟基丁酮解淀粉芽孢杆菌的选育及发酵优化[J]．生物工程学报，2018，34（5）：803-811

[15] 赵延存，李鹏霞，黄开红，等．解淀粉芽孢杆菌BGP20-的诱变选育及生防效果[J]．核农学报，2013，27（12）：1791-1796

[16] Song B，Wang Y Z，Wang G Y，et al．The lipopeptide 6-2 produced by Bacillus amyloliquefaciens anti-CA has potent activity against the biofilm-forming organisms[J]．Mar Pollut Bull，2016，108（1-2）：62-69

[17] Chi Z，Rong Y J，Li Y，et al．Biosurfactins production by Bacillus amyloliquefaciens R3 and their antibacterial activity against multi-drug resistant pathogenic E. coli[J]．Bioprocess Biosyst Eng，2015，38（5）：853-861

[18] Jeyanthi V，Velusamy P．Anti-methicillin Resistant Staphylococcus aureus Compound Isolation from Halophilic Bacillus amyloliquefaciens MHB1 and Determination of Its Mode of Action Using Electron Microscope and Flow Cytometry Analysis[J]．Indian J Microbiol，2016，56（2）：148-157

[19] Gowrishankar S，Poornima B，Pandian S K．Inhibitory efficacy of cyclo（L-leucyl-L-prolyl）from mangrove rhizosphere bacterium-Bacillus amyloliquefaciens（MMS-50）toward cariogenic properties of Streptococcus mutans[J]．Res Microbiol，2014，165（4）：278-289

[20] Ravu R R，Jacob M R，Chen X，et al．Bacillusin A，an Antibacterial Macrodiolide from Bacillus amyloliquefaciens AP183[J]．J Nat Prod，2015，78（4）：924-928

[21] Arguelles Arias A，Joris B，Fickers P．Dual mode of action of amylolysin：a type-B lantibiotic produced by Bacillus amyloliquefaciens GA1[J]．Protein Pept Lett，2014，21（4）：336-340

[22] Regmi S，Choi Y H，Choi Y S，et al．Antimicrobial peptide isolated from Bacillus amyloliquefaciens K14 revitalizes its use in combinatorial drug therapy[J]．Folia Microbiol（Praha），2017，62（2）：127-138

[23] Wu L，Wu H，Chen L，et al．Difficidin and bacilysin from Bacillus amyloliquefaciens FZB42 have antibacterial activity against Xanthomonas oryzae rice pathogens[J]．Scientific Reports，2015，5（1）：463-471

[24] Wu L，Wu H，Chen L，et al．Bacilysin from Bacillus amyloliquefaciens FZB42 has specific bactericidal activity against harmful algal bloom species[J]．Appl Environ Microbiol，2014，80（24）：7512-7520

[25] Xu H M，Rong Y J，Zhao M X，et al．Antibacterial activity of the lipopetides produced by Bacillus amyloliquefaciens M1 against multidrug-resistant Vibrio spp．isolated from diseased marine animals[J]．Appl Microbiol Biotechnol，2014，98（1）：127-136

[26] Arguelles Arias A，Ongena M，Devreese B，et al．Characterization of amylolysin，a novel lantibiotic from Bacillus amyloliquefaciens GA1[J]．PLoS One，2013，8（12）：1-10

Research progress of the identifiation，breeding and antibacterial effects of

PAN Lin1，2，WANG Qinghui3，WANG Shiwei1，2，LI Bo1，2，ZHU Yanwen1，2，LU Sifan1，2，ZHOU Ziqiang1，2

（1. School of Life Science and Agriculture Forestry，2. Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Preservation of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；3. School of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

can be regarded as a microbiological bactericidal agent，which can produce a variety of antibacterial active substances and has a wide sterilization spectrum．It can prevent and cure diseases of crops，vegetables，fruits and melons．The use of this fungicide can help reduce chemical pesticides and ensure food safety．The isolation，identification and its antibacterial effects were reviewed，which lay a foundation for the development and utilization of anti-bacterial active substances．

；identification；breeding；antibacterial effects

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2020.06.013

1007-9831（2020）06-0059-06

2020-02-26

国家自然科学基金面上项目（31670375）；2018年黑龙江省大学生创新创业训练计划资助项目（201810232177）；2018年度黑龙江省教育厅基本科研业务费科研项目（自然科学类面上项目，135309482）

潘林（1964-），男，黑龙江齐齐哈尔人，高级实验师，硕士，从事动物学研究．E-mail：plin@163.com

王世伟（1965-），男，山东肥城人，教授，博士，从事微生物遗传与发酵工程研究．E-mail：wsw888535@shou.com