牛PAI-1 基因真核表达载体构建、生物信息学分析及功能初探

李 锰 ,赵 静 ,刘红羽 ,安 雯 ,王 军* ,吕文发*

（1.吉林农业大学现代农业技术教育部国际合作联合重点实验室，吉林长春 130118；2.吉林农业大学动物生产与产品质量安全教育部重点实验室,吉林长春 130118）

卵巢是雌性哺乳动物繁殖的重要器官，其中卵泡的发生发育至关重要。哺乳动物的大部分卵泡都在生长发育过程中闭锁退化，只有极少数能发育成熟排卵，这种生理状态大大限制了卵泡的充分利用，卵巢颗粒细胞作为卵泡中最重要的体细胞，其在卵泡发生发育过程中起到重要作用。研究发现，卵巢颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的重要原因[1]。本实验室前期研究发现，在凋亡牛卵巢颗粒细胞中纤溶酶原激活物抑制剂1（Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）基因显著下调。PAI-1首先被鉴定为牛主动脉内皮细胞培养基中的纤维蛋白溶解抑制剂，但后来发现它是由许多组织和细胞产生[2]，PAI-1具有抑制纤维蛋白降解、刺激平滑肌细胞增生和促进癌细胞迁移等功能[3-5]。已有研究发现，PAI-1在排卵过程中起关键作用，且人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，hCG）和前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）可提高颗粒细胞PAI-1表达[6-7]，但PAI-1基因在牛颗粒细胞凋亡中的作用机理尚不清楚。本实验旨在构建PAI-1真核表达载体，并对其生理功能进行初步研究，为进一步研究PAI-1基因在牛卵巢颗粒细胞凋亡中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本实验所使用的卵巢组织取自于长春市屠宰场，从刚屠宰的母牛体内取出，置于37℃生理盐水中3～6 h内运回实验室，采用抽吸法提取颗粒细胞。293T细胞由吉林大学唐小春老师惠赠。

1.2 主要试剂 DH5α感受态细胞（货号：CB101）、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（货号：DP209）、质粒小提试剂盒（货号：DP101）、无内毒素质粒大提试剂（货号：DP117）购自北京天根生化科技有限公司，DL2000 DNA Marker（货号：3427A）、T4 DNA Ligase（货号：2011A）、EcoR Ⅰ（货号：1040A）、Hind Ⅲ（货号：1060A）、Premix Taq酶（货 号：RR901A）、反转录试剂盒（货号：RR047A）、RT-qPCR试剂盒（货号：RR820A）购自TaKaRa公司，SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒（货号：P0012AC）、BCA蛋白定量试剂盒（货号：P0010）购自上海碧云天生物技术有限公司，lip2000（货号：11668019）购自赛默飞世尔科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计与合成 根据GenBank数据库公布的牛PAI-1基因CDS序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成扩增全长引物，并分别在上下游引物的5′端添加EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点和保护碱基（下划线部分）。牛PAI-1和人Bcl2、Bax、Caspase-3和β-actin荧光定量引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，引物信息见表1。

1.3.2 牛PAI-1基因CDS序列全长扩增 将提取的牛卵巢颗粒细胞经Trizol法提取总RNA，按照试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板对PAI-1基因进行PCR扩增，20 μL PCR反应体系：Premix Taq 10 μL、上、下游引物（100 pmol/μL）各0.5 μL、cDNA 3 μL、ddH2O补足至20 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃彻底延伸10 min。配制1% 琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳观察。

1.3.3 牛PAI-1基因克隆载体构建 按照胶回收试剂盒要求，对PAI-I基因PCR产物进行胶回收，与pMD-19-T载体16 ℃连接过夜，连接体系为：pMD-19-T 1 μL，胶回收产物4.0 μL，Solution I 5.0 μL。热激法转化DH5α感受态细胞，均匀涂布至带有氨苄抗性的固体LB培养基上倒置培养过夜，随机挑取4～7个单个阳性菌落接种于带有氨苄抗性的液体LB培养基中扩繁，经质粒提取双酶切鉴定阳性的菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，经测序鉴定与GenBank数据库公布的PAI-1基因CDS序列完全匹配的克隆载体命名为pMD-19-T-PAI-1。

1.3.4 牛PAI-1基因真核表达载体构建 使用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ对pMD-19-T-PAI-1和pcDNA3.1（+）进行双酶切，胶回收PAI-1基因片段和线性化pcDNA3.1（+）并将回收片段连接，连接体系：T4 DNA Ligase 1 μL，10×Buffer 1 μL，线性化pcDNA3.1（+）1 μL，PAI-1基因片段7 μL，16℃连接过夜。热激法转化DH5α感受态细胞后采用1.3.3克隆载体鉴定方法进行鉴定，经测序鉴定与GenBank数据库公布的PAI-1基因CDS序列完全匹配的真核表达载体命名为pcDNA3.1-PAI-1。

1.3.5 生物信息学分析 使用NCBI中Blast功能（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对牛PAI-1基因编码氨基酸序列进行同源性比对；使用Prot-Param在线分析软件（https://www.expasy.org/protparam）分析PAI-1基因编码的氨基酸组成、理论分子质量、等电点等基本理化性质；利用在线软件NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）分析PAI-1蛋白的潜在磷酸化位点；利用TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP），PSORT Ⅱ（http://psort.hgc.jp/form2.html）预测PAI-1蛋白的亚细胞定位；利用DNAStar-Protean软件预测PAI-1蛋白的二级结构。

1.3.6 阳离子脂质体法转染293T细胞 将293T细胞接种于6孔板中，接种密度为7.5×105个/孔，培养24 h后，按照lip2000说明书分别将pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1-PAI-1转染至293T细胞内，6 h后添加胎牛血清至终浓度为10%，24 h后更换10%胎牛血清培养液，转染48 h后，收集细胞提取RNA和蛋白。

表1 PCR引物信息

1.3.7 荧光定量PCR（RT-qPCR）采用Trizol法提取293T细胞的总RNA，按照反转录试剂盒要求，将总RNA反转录为cDNA。实时荧光定量PCR反应体系：2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL、上下游引物（100 pmol/μL）各0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O补足至20 μL。反应条件：95℃预变性120 s，95℃变性15 s，退火34 s，扩增40个循环。运用2－△△Ct方法进行数据分析。

1.3.8 Western Blot使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，对提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，蛋白上样量为40 μg，半干转转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，Block Buffer封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，1×TBST洗涤5 min，共洗涤5次，二抗孵育1 h，1×TBST洗涤5 min，共洗涤5次，随后用ECL发光液显影，用Tanon Gis软件进行灰度值分析。Western Blot抗体信息见表2。

表2 Western Blot抗体信息

1.4 统计分析 实验数据用平均值±标准差表示，使用GraphPad prism 5.0对数据进行t检验，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 牛PAI-1基因扩增 以牛卵巢颗粒细胞cDNA为模板，使用扩增全长引物进行PCR反应，结果如图1所示，经1%琼脂糖凝胶电泳验证，条带大小符合目的基因预期扩增片段,约1 226 bp，说明成功扩增出牛PAI-1基因CDS全长序列。

2.2 牛PAI-1基因克隆载体与真核表达载体构建 经连接转化DH5α感受态细胞，提取质粒，使用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ对克隆载体pMD-19-T-PAI-1和真核表达载体pcDNA3.1-PAI-1进行双酶切鉴定，结果如图2所示。由图2可知，酶切条带符合预期片段大小，约为1 215 bp。测序结果经Blast比对，测序片段与GenBank数据库公布的PAI-1基因CDS序列完全匹配（图3）。

2.3 生物信息学分析

2.3.1 基本理化性质 牛PAI-1基因编码氨基酸序列与绵羊、马、猪、人、狗、大鼠、小鼠PAI-1基因编码氨基酸序列的同源性分别为95.52%、86.43%、89.55%、85.32%、88.06%、78.86%、76.87%，提示PAI-1基因在不同物种间相对保守。牛PAI-1基因共编码402个氨基酸，分子式为C2042H3189N539O590S20，分子量为45.37 ku，理论等电点为5.96。如表3所示，PAI-1蛋白共包含20种氨基酸，亮氨酸含量最高，为10.4%，半胱氨酸含量最低，为0.2%，包含44个负电荷氨基酸（天冬氨酸+谷氨酸）和39个正电荷氨基酸（精氨酸+赖氨酸）。

表3 PAI-1蛋白氨基酸组成

2.3.2 磷酸化位点、亚细胞定位分析 在牛PAI-1蛋白中，共预测到35个磷酸化位点，其中21个丝氨酸磷酸化位点、11个苏氨酸磷酸化位点、3个酪氨酸磷酸化位点。PAI-1蛋白的亚细胞定位结果显示，线粒体作用位点占比3.2%，分泌信号作用位点占比98%，说明该蛋白为分泌型蛋白。PAI-1蛋白主要分布在细胞外，其次分布在液泡内，在线粒体、内质网和细胞质也有分布（表4）。

表4 PAI-1蛋白亚细胞定位

2.3.3 二级结构分析 PAI-1蛋白二级结构结果显示，PAI-1蛋白包括24个α螺旋、30个β转角、19个T转角和18个无规卷曲（图4）。

2.4 牛PAI-1基因在293T细胞中表达情况 如图5-A和图6-D所示，牛PAI-1基因在293T细胞中成功表达，转染pcDNA3.1-PAI-1组中PAI-1基因mRNA表达比转染pcDNA3.1（+）组高达4 000多倍，蛋白水平显著升高，而转染pcDNA3.1（+）组未检测出相应条带。

2.5 RT-qPCR检测凋亡相关基因mRNA表达 使用RT-qPCR检测不同转染组凋亡相关基因Bcl2、Bax和Caspase-3mRNA的表达，结果如图5所示，与转染pcDNA3.1（+）组相比，转染pcDNA3.1-PAI-1组中抗凋亡基因Bcl2的mRNA水平极显著升高，促凋亡基因Bax的mRNA水平显著降低，Caspase-3的mRNA水平极显著降低。结果表明，PAI-1能够抑制细胞凋亡。

2.6 Western Blot检测凋亡相关基因蛋白表达 由图6可知，与转染pcDNA3.1（+）组相比，转染pcDNA3.1-PAI-1组中抗凋亡基因Bcl2的蛋白水平极显著升高，促凋亡基因Bax和Cleaved-caspase3的蛋白水平极显著降低。上述结果表明，PAI-1能够抑制细胞凋亡，与mRNA检测结果一致。

3 讨论

表达载体构建技术是一项较为成熟的基因工程技术，将质粒作为载体，使目的基因片段与载体相连转化入细胞使目的基因过表达，常用来研究目的基因在生物过程中的作用。本实验成功构建了牛PAI-1真核表达载体，为进一步研究PAI-1在牛卵巢颗粒细胞凋亡过程中作用及机制提供技术支持。

生物信息学分析结果显示，PAI-1蛋白属于分泌型蛋白，亚细胞定位显示主要分布在细胞外，这与其参与凝血功能相一致。总计预测到35个磷酸化位点，而蛋白磷酸化对于细胞信号传导具有重要作用，说明PAI-1可能参与细胞信号传导。

PAI-1作为纤溶系统中的重要一环，参与纤维蛋白溶解过程，先前研究主要集中PAI-1在心血管系统中的重要作用[8]，但PAI-1在机体很多细胞都可以合成和分泌，提示其具有多种功能，多项研究表明PAI-1参与癌症、糖尿病、肾病等疾病过程[9-11]。实验室前期研究发现，PAI-1基因表达量在凋亡牛卵巢颗粒细胞中显著下调，提示其可能在牛卵巢颗粒细胞凋亡过程中发挥重要作用。PAI-1在抗细胞凋亡方面有重要作用，如在成纤维细胞中，过表达PAI-1可以降低Caspase-3水平，并通过促进p-ERK和p-AKT蛋白分子表达激活ERK和AKT信号通路促进细胞增殖，抑制成纤维细胞凋亡[12]。间充质干细胞（MSC）对热灼伤皮肤伤口产生有利的治疗作用，其中上调的细胞因子PAI-1等可能通过激活PI3K/AKT信号通路来缓解人角质形成细胞和真皮成纤维细胞凋亡促进伤口愈合[13]。此外，大鼠在LPS诱导的急性肺损伤期间，PAI-1可提高Bcl2水平，表现抗凋亡作用[14]。293T细胞是一种常用于研究外源基因表达和功能的细胞株，并且转染容易，本实验结果与上述结果相似，即转染过表达PAI-1可显著提高293T细胞中Bcl2水平，降低Bax和Caspase-3水平，显示出抗凋亡作用。本实验仅在293T细胞中进行初步探究，PAI-1在牛卵巢颗粒细胞凋亡中的作用还需进一步研究。

4 结论

本实验从牛卵巢颗粒细胞克隆出PAI-1基因CDS全长序列，基因编码402个氨基酸，预测到35个磷酸化位点，主要分布在细胞外。本研究成功构建PAI-1基因克隆载体和真核表达载体，在293T细胞中转染PAI-1真核表达载体后，细胞内可成功过表达，并显示出PAI-1抑制细胞凋亡的功能。