连续活体采卵对水牛卵母质量的影响

2020-08-16覃广胜赵朝步陈明棠谭正准钟华配黄加祥

中国畜牧杂志 2020年8期

覃广胜，赵朝步，陈明棠，黄健，李辉，谭正准，钟华配，黄加祥

（中国农业科学院广西水牛研究所，农业部（广西）水牛遗传繁育重点实验室，广西南宁 530001）

水牛是一种重要的家畜资源，它在很多欠发达的农业体系中占据着重要的位置，为人们提供奶、肉，也可作役力。水牛主要繁殖特点是超排反应差[1]、可移植胚胎的回收率以及怀孕率低，同样也存在青春期延迟、发情症状不明显、季节性乏情期等[1]以及产后长时间的乏情期[2-4]等生理特性问题。从长远来看，活体采卵（OPU）和体外胚胎生产（IVEP）是目前生产可转移胚胎（TE）的最具竞争力的技术[5-8]。此外，可以利用OPU对非周期牛、怀孕奶牛以及输卵管或生殖道感染的牛开展研究[7,9]。也可以在对超排没有反应的动物中进行（尤其是水牛）[10]。因此，该方法是超排/胚胎移植（MOET）计划的有效替代方案[8]。由于水牛对激素刺激的反应低，胚胎回收率低[1,8,11]，而且不可能长期重复MOET处理。因此，将OPU-IVEP技术应用于水牛可以提高母亲对遗传改良的贡献[8,11]，从而克服与水牛繁殖季节有关的效率降低的问题。本研究探讨了OPU重复次数对水牛卵母细胞质量的影响，旨在提高水牛胚胎的体外生产效率，为建立高效的水牛胚胎体外培养体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料如果无其他说明，所有化学品和试剂（主要包括青霉素、链霉素、肝素钠、TCM199培养基等）为Sigma公司生产。胎牛血清购自Gibco BRL（Paisley，Scotland，UK）。

1.2 实验动物和活体采卵程序实验水牛选自广西水牛研究所水牛种畜场，共92头水牛（摩拉27头、尼里-拉菲30头和杂交水牛35头），4～12岁，体重580～700 kg。活体采卵程序按照报道[5,7,12]方法进行。活体采卵仪为日本Honda公司生产的HS2000 B型超声波显像仪；配有7.5/5.0 MHz扇形阴道扫描探头（Aloka公司），19G采卵针（针长60 cm，管长120 cm，日本生产），真空泵（FHK，日本富士平公司），恒温槽（日本富士平公司）；50 mL卵泡液收集管。穿刺前测定每个卵巢内卵泡的数目和大小。将直径≥3 mm卵泡穿刺，在真空压力为50 mmHg的条件下，将卵泡液回收50 mL管收集管中。OPU每隔3 d进行1次，连续进行5次。

1.3 卵丘-卵母细胞复合体处理采卵液含DPBS+3%胎牛血清+100 μg/mL青霉素+60 mg/mL链霉素+10 IU/mL肝素。TCM199培养基含5%NBS。根据卵丘细胞复合体（COCs）的形态特征，按张秀芳等[13]提出的方法对卵母细胞进行分类。COCs可分为4类：A级（有两层以上卵丘细胞和均质细胞质的卵母细胞）；B级（至少有一层卵丘细胞和同质细胞质的卵母细胞）；C级（部分剥落的卵母细胞，但仍显示胞质均一）；D级（细胞质不规则皱缩的退化卵母细胞）。A级和B级COCs在体外成熟培养基（TCM199+10%FBS+10 μg/mL FSH+12 U/mL LH+1 μg/mL E2+50 μmol/L半胱氨酸）中，于39℃、5%CO2湿化气氛中培养22～24 h[14]。

1.4 统计分析统计计算连续OPU获得的回收卵母细胞和优质卵母细胞的比例。统计尼里-拉菲、摩拉以及杂交水牛不同批次回收回收卵母细胞和优质卵母细胞的比例。应用SPSS 17.0软件进行统计，以不同批次为固定因子，A、B、C、D及头均可视卵泡数为因变量，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行显著性检验，以P＜0.05作为显著性判断标准，差异显著的采用Duncan´s法进行多重比较。

2 结果与分析

表1显示，连续5次活体采卵时，第1次卵母细胞回收率（65.91%）显著高于第2～5次卵母细胞，而第2、3、4、第5次之间差异不显著，这可能是第1次卵母细胞可穿刺的中等卵母细胞比第2～5次卵母细胞多，便于穿刺，回收率高，而第2～5次小卵泡多。优质卵母细胞（A+B级）1～5次的回收率分别为55.64%、64.05%、70.28%、69.30%、67.65%，优质卵母细胞的平均百分率为66.05%。进行连续活体采卵时，第1、2次优质卵母细胞的百分率比第3、4、5次效果差，第1、2次的优质卵母细胞的百分率与其他批次优质卵母细胞百分率差异显著。第1次活体采卵回收C级卵母细胞（裸卵和网状细胞）所占比例（39.76%）最大，与第2、3、4、5次差异显著。随着重复OPU次数的增加，D级卵母细胞（裸卵和网状细胞）所占的比例不断减少。

从表2可看出，尼里-拉菲水牛C级卵母细胞随着活体采卵次数增加，所占的比例不断减少，第1次活采所占的比例最大与第2、3、4、5次差异显著；优质卵母细胞（A+B级）回收率第2、3、4、5次分别是70.49%、77.71%、69.80%、65.06%，显著高于第1次回收率（52.50%）。摩拉水牛C级卵母细胞变化规律与尼里-拉菲水牛相近，第1次活体采卵C级回收率占比例达47.92%，与第2、3、4、5次差异显著；优质卵母细胞（A+B级）回收率在48.43%～79.76%，第1次与第2、3、4、5次差异显著。第1次卵母细胞回收效果最好（63.06%），与其余4次差异显著。从表2也可看出，杂交水牛A级卵母细胞回收率比尼里-拉菲和摩拉水牛好，并且效果相对稳定，而第1次的卵母细胞回收率（70.95%）与第2、3、4、5次差异显著。总而言之，不同水牛品种在C级、优质卵母细胞回收率和卵母细胞回收率不同。

3 讨论

3.1 连续活体采卵对卵母细胞回收率的影响卵母细胞回收率受多种因素影响，如活体采卵频率等。黄右军等[15]报道，第1次活体采卵回收率为78.5%，第2次回收率为62.0%，第3次为51.2%。梁贤威等[16]报道，连续活体采卵第1、2、3次采卵平均穿刺卵泡数和头均回收的卵母细胞数虽存在差异，摩拉水牛卵母细胞回收率为70.02%，尼里-拉菲水牛为67.41%。而本实验进行连续5次活体采卵时，卵母细胞回收百分率比梁贤威等[16]的结果低（65.91%、48.16%、43.54%、50.77%和47.31%），但连续活体采卵，卵母细胞的回收率随着采卵次数增加而呈下降趋势，这与黄右军等[15]报道的结果相近。陈明棠等[17]对富钟水牛进行活体采卵，发现随着活体采卵次数增加，卵母细胞回收率下降。许红喜等[18]对雪龙黑牛的活体采卵结果表明，每周采卵1次，第1次卵母细胞回收率70%，第2次采卵回收率44%。这可能是第1次穿刺卵母细胞中等卵泡数量比第2、3、4、5次多，便于穿刺。另外，随着穿刺次数增加，卵母细胞募集速度变慢，所以可视卵泡数量减少。加上穿刺次数增加，卵巢受损增加，导致卵泡数量减少，从而回收率下降。

表1 采卵批次对活体采卵卵母细胞质量的影响

表2 不同品种连续活体采卵对卵母细胞质量的影响

3.2 连续活体采卵对优质卵母细胞回收率的影响本实验研究结果表明，第1次活体采卵的优质卵母细胞百分率最差，第2次不断增加，第3、4、5次保持相对稳定。这可能与各批次之间C级卵母细胞变化相关，本实验中随着活体采卵次数增加，C级卵母细胞（裸卵和网状细胞）所占的比例不断减少。本研究平均优质卵母细胞（A+B级）的百分率为66.05%，与梁贤威等[16]报道优质卵母细胞回收率为70.92%相似，与Yadav等[19]报道的经马绒毛膜促性腺激素（eCG）处理的摩拉母水牛活体采卵回收率（71.60%）以及未经处理的摩拉水牛卵母细胞平均回收率（64.18%）结果相似。比Di Francesco等[20]报道对意大利地中海水牛开展活体采卵效果好，其优质卵母细胞百分率在52.7%～65.6%。本研究的结果表明，第1次活体采卵优质卵母细胞百分率低的原因，可能是由于第1次比其他各次的闭锁卵泡较多，加上水牛卵母细胞透明带脆弱和颗粒细胞与卵母细胞之间的连接不紧密相关，这与Le Van Ty等[21]报道卵泡闭锁水平较高的观点一致。随采卵次数增加，闭锁卵泡减少，C和D级卵母细胞所占比例减少，卵母细胞质量提高，因而回收的可用卵母细胞比例也随之增加。

3.3 不同品种水牛连续活体采卵对采卵效果的影响本实验表明，尼里-拉菲水牛连续5次采卵，各批次卵母细胞回收率差异不显著，但优质卵母细胞百分率差异显著，第1次与第2、3次和5次相比回收效果最差；对卵母细胞回收率而言，摩拉水牛第1次回收效果最好，达63.06%，而其余各次回收率分别是46.32%、35.69%、47.01%、45.54%；优质卵母细胞百分率在48.43%～79.76%，第1次与其余各次间差异显著；但杂交水牛回收卵母细胞率、优质卵母细胞回收率差异不显著。与梁贤威等[16]报道的尼里拉菲、摩拉水牛卵母细胞回收率（67.41%、70.02%）相比差异较大。但比阿根廷的摩拉水牛活体采卵[23]效果好，其连续对摩拉水牛活体采卵6次，每次间隔7 d和14 d，平均每次卵母细胞回收率分别是31.5%、51%。优质卵母细胞回收率与富钟水牛[17]也有差异（激素处理组回收率为70.88%，未处理组为60.2%）。但与Neglia等[23]报道连续18次（每周采卵2次）活采非泌乳的地中海水牛优质卵母细胞（A+B级）平均回收率58.5% 相接近。Gimenes等[24]报道，用同期发情方法处理3个品种青年牛的第5、7、9天后进行活体采卵，结果表明巴西的瘤牛、荷斯坦牛和水牛卵母细胞回收率分别是82.3%、66.7%、72.5%，优质卵母细胞回收率分别是68.8%、57.7%、60.9%，瘤牛活体采卵效果比水牛和荷斯坦牛效果好，这是由于瘤牛的可视卵泡数比奶牛和水牛的多。总而言之，不同品种之间，水牛活体采卵效果不一致。