延边半细毛羊羊毛细度测定及其CD200 基因克隆与表达分析

2020-08-16刘晓军关喜东张立春孙福亮

中国畜牧杂志 2020年8期

刘晓军，关喜东，于宁，姜楠，张立春，孙福亮*

（1.延边大学农学院，吉林延吉 133000；2.图们市农业和畜牧业局，吉林图们 133100；3.吉林省农业科学院畜牧分院，吉林公主岭 136100）

延边半细毛羊是延边地区特有的品种，是以当地杂种羊为母本，以考力代羊为父本，通过逐级杂交选育出的品系[1]。近年来养殖户又引进德国美利奴种羊，与延边半细毛羊母羊进行杂交，以进一步提升延边半细毛羊的羊毛品质及肉品质，但未有研究对新杂交后的延边半细毛羊羊毛细度进行过测定。因此，本实验对新改良后的延边半细毛羊的羊毛细度进行检测，为延边半细毛羊的育种提供数据参考。

近年来，随着毛纺产品向轻薄、柔软、挺括、高档方向发展，国内外学者加强了对羊毛细度相关基因的研究[2-3]，如王小佳等[4]研究表明BMPR1B基因的mRNA表达量与羊毛细度呈显著正相关，相关系数为0.382；张文建等[5]鉴定出中国美利奴羊CCNY基因的3个SNP位点与羊毛细度显著相关；Zhang等[6]通过RNA-seq分析得到CD200在毛纤维直径差异显著的小尾寒羊和新吉细毛羊皮肤中表达量差异显著。

CD200基因又称MRC OX2，由McMaster等[7]于1979年发现，是一种细胞表面的跨膜糖蛋白，与其受体CD200R均属于免疫球蛋白超家族。CD200在胸腺、神经系统、血管内皮、滋养层、子宫、免疫系统等组织中广泛表达。有研究报道CD200-CD200R相互作用能减弱炎症反应，提高免疫耐受性，降低器官移植的排斥反应等[8-11]。近年来研究发现CD200也与动物毛发的发育密切相关，如Rosenblum等[12]研究发现CD200基因在小鼠毛囊外根鞘的角质形成细胞上表达；CD200在人的毛囊中亦有表达，并且与毛囊干细胞标记物有关，进而成为鉴定、分选毛囊干细胞的重要标识[13]；CD200也作为羊毛囊干细胞的标记基因而用于筛选毛囊干细胞[14]，但国内外尚未报道CD200在绵羊羊毛品质方面的研究。因此本实验对延边半细毛羊皮肤毛囊中CD200基因进行克隆与定位来探讨其与羊毛细度的相关性，为延边半细毛羊群体的育种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与样品采集本实验从龙井市某养殖场选择在相同条件下饲养的体重相近的10月龄雌性延边半细毛羊20只，对其肩胛部进行剪毛，并收集毛样；将剪过毛的皮肤用75%的酒精消毒后，剪取1 cm× 1 cm皮肤组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，再剪取100 mg左右组织皮肤放入液氮中冷冻保存。

1.2 主要试剂 Trizol试剂盒购自Invitrogen公司；DNA Marker、DNA胶回收试剂盒、pMD19-T载体、RNasefreeDNase Ⅰ及大肠杆菌 DH5α均购自于宝生物工程（大连）有限公司；DNA质粒提取试剂盒与反转录试剂盒购于广州飞翔生物工程有限公司，免疫组化试剂盒购自上海生工生物股份有限公司。

1.3 羊毛细度测定羊毛经过乙醚洗涤处理后，切取距离毛根2/3处的断面在羊毛测定仪检测羊毛直径。将测得的数据用SPSS软件求平均数±标准差，再根据《绵羊毛》（GB 1523—2013）国标细度来判定改良后的延边半细毛羊的羊毛细度。

1.4 免疫组化实验取固定好的皮肤组织进行脱水、包埋、切片后，将 4 μm厚的切片在烤片机上65℃烘烤1 h，后续步骤参照免疫组化试剂盒进行操作。

1.5 引物设计与合成根据GenBank上的序列（登录号：XM_012190412）与Oligo7.0软件设计引物，引物序列为F：5'-CGCGGATTCATGTTATGCAGGGCACAAGTG-3'，R：5'-CCCAAGCTTCTAGGGCTCTCGATCTTGGT T-3'，引物由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.6 RNA提取及cDNA合成用Trizol法提取皮肤总RNA：称重100 mg皮肤组织样品，放入预冷的研钵中研磨，研磨成粉末后转入1.5 mL离心管中，后续步骤按Trizol说明书进行，提取出的RNA用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。以皮肤中总RNA为模板，通过RT-PCR反应合成cDNA第一链，反应步骤参照反转录试剂盒说明书操作。

1.7 PCR扩增以CD200基因的cDNA为模板进行PCR扩增，其反应体系为20.0 μL：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，0.3 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，Taq酶0.3 μL，ddH2O 11.7 μL，MgCl23 μL。反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性45 s，69℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，72℃再延伸15 min，4℃保存。PCR扩增产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8CD200克隆用胶回收试剂盒回收目的片段，取纯化的PCR回收产物与MD19-T载体混匀后在4℃条件下过夜，再将质粒pMD19-T-CD200转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于氨苄抗性的固体LB平板，37℃条件下培养12～16 h。经蓝白斑筛选后，接种到氨苄抗性的LB液体培养基37℃继续培养12 h，用DNA质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒，对重组质粒用PCR鉴定，阳性结果送至上海生工生物股份有限公司测序。

1.9 生物信息学分析用 EditSeq（DNAStar）对测序结果进行分析，通过MegAlign（DNAStar）软件对延边半细毛羊和绵羊（登录号：XM_004002915）、山羊（登录号：XM_018065460）、牛（登录号：XM_024990382）、野猪（登录号：XM_021070383）、猫（登录号：XM_023260131）、人（登录号：NM_005944）、小鼠（登录号：XM_017316889）进行CD200基因序列的同源性分析，并构建基因进化树；采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）工具对绵羊CD200基因编码蛋白基本理化性质进行分析，用在线GOR4工具与Protean（DNAStar）对CD200蛋白的二级结构进行预测及分析，进一步利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasyorg/）预测三级结构。

2 结果

2.1 羊毛细度分析羊毛纤维直径为（19.26±2.69）μm（为66支左右），已达到细毛羊的细度，说明用德国美利奴羊改良后延边半细毛羊羊毛品质显著提高。

2.2 免疫组化实验经免疫组化染色后发现（图1），CD200基因在毛囊的外根鞘、毛囊干细胞及表皮层位置表达。因此，通过检测CD200在皮肤毛囊中的表达部位，对其在皮肤毛囊中的作用研究奠定理论基础。

2.3 绵羊CD200基因PCR扩增与鉴定提取组织中的总RNA，以皮肤中的cDNA为模板，PCR扩增产物电泳检测结果显示，成功扩增出了延边半细毛羊CD200基因，大小约为729 bp，与目的条带一致（图2）。对重组质粒pMD19T-CD200进行PCR鉴定，发现在约729 bp处出现1条特异性条带，与CD200基因大小相符（图3），表明获得了重组表达质粒pMD19T-CD200。

2.4 序列分析及同源性比对测序结果全长为729 bp，将测序结果用Seqmen软件进行拼接，经GenBank数据库（登录号XM_012190412）Blast N比对鉴定，克隆的CD200基因片段大小与原始基因一致，显示该片段CDS区长为729 bp，比对后发现存在2个SNP位点，同源性为99.7%。对各物种的同源性分析结果显示延边细半毛羊的CD200基因与绵羊、山羊、牛、猫、人、野猪、小鼠的同源性分别为99.7%、99.5%、97.6%、88.4%、85.0%、81.9%、79.3%，说明各物种间同源性相对较高，但随着物种进化距离的增加，CD200基因也相应表现出同源性降低的现象。

2.5 系统进化树构建如图4所示，延边半细毛羊CD200基因与绵羊的亲缘关系最近，与鼠的亲缘关系最远，在同一物种间及不同物种间比较分析得出该基因在生物进化中比较保守。

2.6 理化性质分析将测序结果用Edit Seq分析得出该基因长度为729 bp，编码242个氨基酸，1个终止密码子不编码氨基酸，氨基酸序列见图5，用Megalign（DNAStar）对克隆到的延边半细毛羊基因和XM_012190412所编码的氨基酸残基进行比对分析，发现第193个氨基酸残基不同，由G变为R，说明该位点基因突变属于错义突变，第117个氨基酸残基没有改变，说明编码此处的基因突变属于沉默突变。延边半细毛羊CD200蛋白理化性质分析结果显示，该蛋白的相对分子量为26.97 ku，分子式为C1212H1941N323O349S11，理论等电点为8.82，亲水性为0.086，不稳定系数为36.73，表明该蛋白为稳定的碱性疏水性蛋白。

2.7 蛋白亲水性分析当亲水性的值大于零时，蛋白为疏水性蛋白，反之则为亲水性蛋白。经预测CD200蛋白存在较多疏水性区域，与采用ProtParam工具分析所得的结果一致，为疏水性蛋白。说明水相中CD200蛋白内部带有非极性侧链的氨基酸形成的疏水区域较大，从而引起熵的降低及蛋白折叠程度的增大。

2.8 二级结构及三级结构预测预测到CD200蛋白二级结构包括α螺旋、延伸链、无规则卷曲构成（图6），其中无规则卷曲135个，占二级结构的55.79%，结合蛋白的骨架柔性分析，说明CD200蛋白易发生扭曲及折叠。

CD200蛋白的三级结构结果表明，CD200蛋白的空间结构复杂，是由多个二级结构紧密缠绕形成的球状结构（图7）。

3 讨论

近年来世界羊毛品质出现了划时代的变革，主要表现在羊毛细度方面。如澳大利亚是世界羊毛产量最多的国家，最近几年其羊毛总产量虽有减少，但平均直径小于19 μm的细羊毛产量大幅增加，我国也正用基因调控、引进超细型种羊进行杂交等方式提升羊毛细度，说明细毛羊养殖正在变革羊毛品质的发展[15-16]。《绵羊毛》（GB 1523—2013）国家标准中将羊毛细度在66支（直径小于25.0 μm）以上的羊品种定位为细毛羊类，经检测延边半细毛羊的羊毛平均直径为（19.26±2.69）μm，对比澳洲羊毛和国标说明延边半细毛羊品系具有良好的羊毛细度，且在纤维细度方面有稳定的遗传。

羊毛的细度、长度、弯曲度等性状早在毛囊时期就已经决定，因此要调控羊毛的性状应对毛囊的形成及机理进行调控分析，但羊毛的组成成分复杂，羊毛形成不仅受角蛋白中间丝（Keratin Intermediate Filament，KRTIF）和角蛋白辅助蛋白（Keratin-associated proteins，KAPs）这两个家族中的多个基因联合表达的影响，也受Sox9、Lhx2、Tcf3/4、Nfatc1、Gab1、CD200等多个转录因子的周期性调控[17]。乃门塔娜[18]研究证明干扰Sox9表达后的毛囊干细胞无法完成从S期到G2/M期的过渡；Özlem等[19]研究发现Gab1和Mapk信号在头发周期和毛囊干细胞静止过程中起着至关重要的作用；Zhang等[6]通过RNAseq分析出CD200为小尾寒羊和新吉细毛羊的差异基因，其在毛纤维较粗的小尾寒羊皮肤中表达极低，在新吉细毛羊皮肤中表达高；本研究中延边半细毛羊的羊毛细度较细，接近新吉细毛羊的细度，而且也成功地从其皮肤中克隆出了CD200基因，且定位在皮肤毛囊部位表达，与李东江等[20]报道的毛细度较粗的云南半细毛羊皮肤中未检测到CD200基因的结论一致，进而说明CD200基因在细毛羊中表达较高，而在半细毛羊或粗毛羊中表达低或不表达。因此，推测CD200基因是引起羊毛细度的差异基因，可能对羊毛细度起调控作用。

本实验采用酶标抗体法检测到CD200在毛囊的外根鞘、毛囊干细胞及表皮层表达，与Rosenblum[11]检测的CD200基因在小鼠皮肤的表皮层、外根鞘及毛囊干细胞中表达一致。Sanja等[21]研究发现CD200能维持和更新角膜缘表皮细胞，因此可推测绵羊表皮高表达的CD200基因也可能参与到皮肤表皮细胞的维持和更新，CD200在毛囊干细胞与外根鞘表达推测该基因可能参与毛囊周期性的发育及毛发性状的调控，但有待进一步证实。本实验中，对延边半细毛羊CD200基因与其他物种比对，发现该基因在物种进化过程中比较保守，且能稳定遗传；通过对CD200蛋白的二级结构及三级结构的预测，为深入研究绵羊的CD200蛋白提供基本的数据资料，也为CD200调控羊毛细度表达作用机理的研究奠定理论基础。