HPLC法测定补肾养骨口服液中淫羊藿苷的含量

王汝山

广东省阳江市中医医院，广东 阳江 529500

补肾养骨口服液为本院的院内制剂，由淫羊藿、续断、牛大力等四味中药饮片制成，具有补肾壮阳、强筋健骨功效，用于老年性骨质疏松症以及肾虚体倦、四肢麻木、腰膝酸痛、性欲减退等症。本制剂原质量标准偏低，仅有薄层鉴别、pH值、相对密度和微生物限度检验项目，缺少能评价制剂质量好坏的关键指标。为了确保制剂临床疗效，本实验对补肾养骨口服液的君药淫羊藿开展含量测定，以淫羊藿苷作为质量指标成分[1]，建立了淫羊藿苷的高效液相色谱测定方法，结果表明该方法能准确检测补肾养骨口服液中淫羊藿苷含量，达到可用于本制剂质量控制的目的。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪；AB 135-S电子天平(梅特勒-托利多)；AB204-N型天平(梅特勒-托利多)；超纯水机(北京历元电子仪器)；SB25-12DTD数控超声清洗器。

1.2 材料 补肾养骨口服液(医院自制，包装规格：10 mL×10支/盒，批号：20190801、20190802、20190901、20190902、20191001、20191002)；淫羊藿苷对照品(含量以94.2%计，批号：110737-201516，中国食品药品检定研究所)；乙腈和甲醇均为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(26∶74)；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

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2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品16.5 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含淫羊藿苷0.165 mg的对照品贮备溶液。精密量取对照品贮备溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含淫羊藿苷0.0495 mg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取本品6 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇振摇5 min，放冷，加溶剂稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取缺淫羊藿的阴性制剂6 mL，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 按照“2.1”项下色谱条件，分别测定对照品溶液、供试品溶液与缺淫羊藿的阴性样品溶液，记录色谱图，结果在供试品色谱图中，在与淫羊藿苷对照品溶液色谱图相应保留时间处有相应的淫羊藿苷峰出现，而阴性对照无干扰，表明具有良好专属性，色谱图如图1所示。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品贮备溶液1、2、3、4、5 mL，置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释制成含淫羊藿苷质量浓度分别为0.0165、0.0330、0.0495、0.0660、0.0825 mg/mL 的系列对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别进样10 μL，以峰面积为纵坐标(Y)，以质量浓度(mg/mL)为横坐标(X)进行线性回归，得到线性方程为Y=21905X-0.9030，r=0.9997，表明淫羊藿苷在0.0165 ～0.0825 mg/mL范围内的线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，连续重复进样6次，每次进样量为10 μL，分别测定并计算，结果淫羊藿苷峰面积的RSD值为1.25%(n=6)，表明本法精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于第0、1、2、4、8 h取样，进样量为10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算出淫羊藿苷峰面积的RSD值为1.45%(n=5)，表明在8 h内供试品溶液具有良好的稳定性。

2.7 重复性试验 分别取6份同一批号样品，按“2.2.2”项下制备方法制备6份供试品溶液，分别测定，样品含量测定的RSD值为0.02%(n=6)。

2.8 加样回收率试验 精密量取已知含量为0.445 mg/mL的本品溶液3 mL,共6份，分别精密加入淫羊藿苷对照品贮备溶液7 mL(0.165 mg/mL)，摇匀，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果 (n=6)

2.9 样品含量测定 取不同批号的本品6批，按“2.2.2”项下制备方法制成供试品溶液，分别进样10 μl，测定淫羊藿苷含量，6批样品的平均含量为0.44 mg/mL，见表2。考虑到生产中原料饮片的产地、采收与加工以及制剂生产工艺条件存在偏差等因素的影响，实际生产不同批次的制剂含量测定结果存在波动，故取含量均值的80%作为含量测定标准的下限，规定本品每1 mL含淫羊藿以淫羊藿苷计，不得少于0.35 mg，作为本制剂HPLC法含量测定的内控标准。

表2 样品中淫羊藿苷含量测定结果 (n=6)

3 讨论

本实验参考文献[2～4]考察了3种比例的乙腈-水(体积比分别为26∶74、27∶73、30∶70)和2种比例的甲醇-水(体积比分别为63∶37、65∶35)作为流动相的分离效果，结果发现采用乙腈-水(26∶74)时，样品中的淫羊藿苷能较好与其它组分达到基线分离，此时色谱峰出峰时间适宜，峰型尖锐对称。

由于补肾养骨口服液中的淫羊藿苷在贮存过程会存在水解，经过对本制剂1年稳定性考察结果发现，含量测定结果均符合内控标准的规定，表明所建立的HPLC法可用于补肾养骨口服液质量控制，亦可为补肾养骨口服液质量标准修订提供依据。