丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对大鼠油酸致急性肺损伤纤维化的干预效应研究

刘志平，李粉英，黄 桑，罗 力，陈远彬，何光范，曾昭智

[1.广东药科大学附属第二医院(广州新海医院)，广东 广州 510300；2.广东省中医院，广东 广州 510120；3.广东药科大学实验动物中心，广东 广州 510006]

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种急性的重症，在临床并不少见。造成ALI的原因很多，根本原因是肺泡毛细血管的细胞膜因为某些原因通透性增高，往往导致重症监护患者短时间内死亡。现有研究表明[1-5]，在患者的肺内发生了多种由炎性因子和炎性细胞浸润的反应，这些反应在肺泡上皮细胞等作用下被逐级放大，炎性反应也由此更为严重。而细胞因子本身的作用又是通过网络发挥作用的，具有协同性和叠加性。现在已经有了大量研究证明，ALI早期患者的肺中已经出现了纤维化，这种纤维化的程度又直接影响了病情进展，甚至能够影响预后。因此，通过研究ALI中的炎性因子了解ALI纤维化是怎样发生的，以及怎样或采取何种药物进行干预，终极目的在于更好地治疗ALI，抑或是开辟预防ALI新途径。遗憾的是目前并没有特效药物可以针对ALI进行良好的治疗。本研究选择的药物是丹参酮Ⅱ-A磺酸钠，以期从中国传统药物中寻找思路，使用大鼠与油酸，将大鼠诱导出现急性肺损伤纤维化之后再采用药物进行干预，采大鼠血液检查白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)，探讨其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1实验资料

1.1.1药物与试剂：丹参酮Ⅱ-A磺酸钠注射液(上海上药第一生化药业有限公司，批号：1603102)，IL-1、TNF-α、PCⅢ ELISA检测试剂盒(上海哈灵生物科技有限公司，批号：201705)，油酸(天津市致远化学试剂有限公司，批号：2016110142)，10%中性福尔马林(广州化学试剂厂，批号：20150303)。

1.1.2仪器：FA2004B电子天平(上海精科天美)，HZT-A1000电子天平(厦门华志)，RM2235切片机(德国徕卡)，AE2000倒置显微镜(厦门麦克奥迪)、HCP246恒温培养箱(德国Memmert)，3K15冷冻离心机(德国SIGMA)，Infinite 200 pro酶标仪(瑞士tecan)，血气分析仪(美国 ABBOTT 公司)，Forma 902超低温冰箱(美国Thermo)。

1.1.3动物：本研究所用的均为雄性SD大鼠[由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(粤)2012-1125，合格证号SCXK(粤)2016-0041]，180～220 g购买好实验用大鼠后，先将之饲养在屏障环境中。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1建立ALI 大鼠模型：全部大鼠共66只，将油酸一次性从尾静脉注射进入大鼠体内，12 h后从大鼠的尾动脉中取约0.2 ml血液监测氧合指数，若达到PaO2/FiO2≤300就说明造模成功，进行下一步工作。

1.2.2分组及各自的处理：取没有注射油酸的24只大鼠，自尾静脉中注射与造模组等量的生理盐水作为对照组。另外在建模成功的大鼠中选取48只，随机平均分成两组，其中一组为模型组，另一组为丹参酮治疗组，在这两组小鼠腹腔中以2 ml/kg的量注射生理盐水。丹参酮治疗组腹腔注射丹参酮Ⅱ-A磺酸钠注射液10 mg/kg，连续14 d每天进行一次注射。于停药第7天随机处死12只大鼠，第14天时再次处死余下的12只，取相应部位样品检测。

1.3观察指标：体重测定：给药前、停药第7天、停药第14天。血气分析样品：大鼠动脉血，时间：给药前、停药第7天、停药第14天。指标：PaO2、PaO2/FiO2。肺指数、肺组织湿/干重测定时间：停药第7天、停药第14天；样本：大鼠全肺，计算公式：肺指数=肺重(mg)/体重(g)。干重处理温度：60 ℃，干重处理时间：72 h；湿/干质量比(W/D)计算目的：肺水肿程度。用大鼠左肺。肺组织病理:停药第7天、停药第14天。固定液：10%福尔马林；样本：大鼠的右肺上叶，石蜡包埋切片后染色镜检。主要观察指标：肺泡水肿、间质水肿、出血、肺不张、肺坏死、炎性细胞浸润、肺充血、纤维化等。

1.4血清TNF-α、PCⅢ以及IL-1 含量测定：分别于停药第7天和第14天大鼠动脉采血3 ml，1 000 r/min离心10 min，分离取用血清，ELISA法测定TNF-α、PCⅢ以及IL-1水平，严格按照ELISA试剂盒说明书要求进行操作。

2 结果

2.1丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对ALI大鼠体重的影响：丹参酮治疗组的大鼠体重与其他两组在停药7 d和14 d后，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。提示丹参酮Ⅱ-A磺酸钠ALI大鼠体重无明显影响。

表1 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对ALI大鼠体重的影响

2.2丹参酮Ⅱ-A磺酸钠治疗处理后ALI大鼠血液PaO2及PaO2/FiO2结果变化：模型组及丹参酮治疗组给药前PaO2及PaO2/FiO2结果值均明显低于正常对照组，证明ALI大鼠成功造模。停药7 d和14 d后，丹参酮治疗组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，明显高于模型组大鼠，见表2。

表2 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对ALI大鼠血液PaO2及PaO2/FiO2结果变化情况

2.3丹参酮Ⅱ-A磺酸钠治疗处理后ALI大鼠的肺指数、湿/干重比变化情况：停药7 d和14 d后，正常对照组肺指数及湿/干重比均有不同程度降低，丹参酮治疗组肺指数及湿/干重比均有不同程度降低，对比模型组而言，部分结果差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对ALI大鼠肺指数以及湿/干重比变化情况

2.4病理学结果

2.4.1肉眼观察结果：模型组有肺水肿，肺表面出现血红病变等症状，并且体积增大。丹参酮Ⅱ-A磺酸钠干预后，血红病变减少，水肿等接近正常组。

2.4.2光镜观察结果：正常组肺泡腔无损坏，未见肺泡炎细胞、肺水肿、支气管上皮变形、管周炎和支气管纤维化。模型组镜下未见肺泡腔，肺泡壁镜下明显增厚，可见较多炎细胞，可见明显肺水肿，支气管上皮严重变形，可见明显纤维增生伴有肺结构破坏。丹参酮Ⅱ-A磺酸钠治疗后可见明显的肺水肿好转，支气管变形情况消失，炎细胞明显减少，纤维化程度大幅减轻，见图1。

A：正常对照组：HE ×100

2.5丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对ALI大鼠血液TNF-α、PCⅢ以及IL-1 水平的影响：正常对照组和丹参酮治疗组大鼠，相比模型组，在停药7 d和14 d后，外周血中IL-1、TNF-α、PCⅢ水平均有所降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对ALI大鼠外周血中IL-1、TNF-α、PCⅢ水平的影响

3 讨论

用油酸来制作ALI模型是得到了广泛应用的ALI研究模型之一，建模容易成功，结果过以渗出、炎性反应和纤维增殖阶段为特点[6-8]，早期即可观察到肺纤维化。

本研究给大鼠注射了一定量的油酸，诱发了大鼠的肺充血水肿，出现炎性反应，肺泡壁增厚，大量炎细胞浸润，并且发生明显的肺损伤和纤维化，这些变化是对临床上ALI纤维化进程中病理变化的良好模拟。从PaO2/FiO2≤300及肺水肿、肺指数等指标来看，造模后的大鼠都明显高于正常对照[9]，表明进行了成功的造模成功。经丹参酮Ⅱ-A磺酸钠治疗，可见明显的肺水肿好转，支气管变形情况消失，炎细胞明显减少，纤维化程度大幅减轻，同时能提高动物血液中PaO2、PaO2/FiO2指数。

ALI纤维化过程中炎性变化有重要意义，IL-1、TNF-α等炎性因子促使大量中性粒细胞聚集于肺组织中，它们一般都黏附于肺毛细血管内皮细胞上，诱发细胞释放蛋白酶、氧自由基等，并且释放更多炎性介质等，损伤细胞，这些就是肺纤维化的病理基础，由此可能发生的不仅仅是肺组织中毛细血管通透性增高，使得肺泡液伴随大量蛋白质渗出，还可能形成透明膜。PCⅢ是胶原纤维所特有的，可以用作机体组织纤维化的标志物，其含量的变化与胶原的形成代谢有一定的相关性，因此用以判断组织纤维化程度。本实验发现在油酸诱导的ALI纤维化模型中TNF-α、PCⅢ以及IL-1 大量表达，再次证明了先前国内外相关文献研究成果[10-11]，经丹参酮Ⅱ-A磺酸钠治疗后，上述三种因子的水平显著降低，可以解释为丹参酮Ⅱ-A磺酸钠能够有效保护ALI纤维化油酸大鼠肺模型，其方式有二，一是直接减少IL-1、TNF-α，二是通过降低PCⅢ，从而减少胶原蛋白沉积在细胞外基质中，从而达到防治ALI纤维化的作用[12]。但本研究并没有进行信号通路的研究，所以也无法解释到底哪种调节机制在疾病的形成中发挥了作用，因此需要后期实验室中更加完善的设计和更深入的研究来进行说明。

综上所述，丹参酮Ⅱ-A磺酸钠在某种程度上能够有效治疗油酸模型大鼠ALI纤维化，作用机制可能涉及了炎性因子的调节作用。但其对炎性因子水平调节机制和对信号通路的影响需做更进一步的研究。