ABCC1促进人正常肺上皮细胞BEAS-2B恶性转化的作用研究

李兴江，王鹏宇，宋妍婕，冯玉宽

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

当前，肺癌仍是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，成为危及健康和生命的主要恶性疾病之一[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)为最常见的肺癌类型，约占肺癌人群的 85%，主要包括肺腺癌及鳞癌两大病理类型[2]。多药耐药相关蛋白1(Multidrug Resistance-associated Protein 1: coded by ABCC1,MRP1/ABCC1)是一种ATP转运蛋白，它利用ATP水解的能量实现底物在细胞内外的跨膜转运，是肿瘤多药耐药(multi-drug resistanc-e，MDR)的主要靶标。ABCC1在多种肿瘤中高表达，例如肺癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌和膀胱癌[3-7]。虽然ABCC1介导的肿瘤耐药研究有较多报道，但是ABCC1在肿瘤细胞中的高表达对肿瘤细胞恶性表型的影响，特别是ABCC1对非小细胞肺癌恶性转化的能力的影响及其表达失调控的机制仍不确切。因此，评估ABCC1对非小细胞肺癌转化能力影响具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)购于中科院上海生物化学与细胞生物学研究所。EGM培养基、胎牛血清从赛默飞世尔科技(中国)有限公司购买。pcDNA-copGFP慢病毒表达载体和Lipofectamine TM 2000 Reagent试剂盒购自北京索莱宝公司。SYBR PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒购自宝生物工程公司。引物、抗体购于锐博公司。CCK-8购自于贝博公司，Matrigel基质胶购于碧迪公司，Transwell小室于康宁公司购买。

1.2 细胞培养与慢病毒转染将从4℃冰箱中取出的EGM培养基与10% FBS混合制成完全培养基，并将恒温细胞培养箱调节为37℃、CO2浓度调为5%，培养细胞。取对数生长期的细胞用于实验，按每孔3×105细胞接种于6孔板中。用针对人ABCC1 CDS区的PCR引物扩增PCR产物，并克隆至慢病毒穿梭质粒构建表达载体pcDH-ABCC1。构建的载体以DNA测序进行鉴定，表达ABCC1的慢病毒表达载体命名为Lv-ABCC1。应用Lipofectamine 2000 将Lv-ABCC1慢病毒质粒和空慢病毒(Lv-Control)质粒转染239T包装细胞，转染48h后收集病毒感染ABCC1。

1.3 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)收集的细胞用Trizol试剂提取总RNA，以总RNA为模板获得DNA互补链，按试剂盒说明使用PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒。cDNA样品用于PCR扩增反应。每个样品进行三次独立重复检测，以均值进行进一步统计分析。

1.4 免疫印迹实验(Western Blot)收集细胞，弃去上清液，PBS清洗细胞3次，加入细胞裂解液后，细胞收集并置于冰上。细胞裂解液匀浆收集。充分裂解，13000 r/min离心30 min。收集上清液，蛋白定量后与上样缓冲液混合均匀，100℃水浴变性。SDS-PAGE胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2h；一抗4℃孵育过夜，TBST液清洗3次；二抗室温1h；TBST液洗3次。ECL显色，化学发光成像系统Laser-4000拍照、统计、分析结果。

1.5 CCK-8实验在96孔板中配置100μL的细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24h(37℃，5% CO2)，向每孔加入10μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育3h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，重复检测3次。

1.6 流式细胞周期检测实验单细胞悬液制备，分离的细胞，离心沉淀后用0.3mL含10%小牛血清的PBS悬浮，移入1.5mL EP管中，加入0.7mL无水乙醇，置-20℃下固定24h以上。3000 r/min离心30s，弃上清液，用 lmL PBS重悬细胞，再离心洗涤细胞1次。弃上清液，沉淀细胞用100μL 1mg/mL RNase A悬浮，37℃下放置30min。加入400μL 50μg/mL PI，置暗处10min。最后用流式细胞仪测定。

1.7 Transwell实验Matrigel基质胶以1：8稀释后包被Transwell小室底部膜的上室面(冰上操作)，3h风干，水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50μL 10g/L BSA无血清培养基，37℃，30min，常规胰酶消化细胞，PBS洗1～2次，去除血清的影响，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×105cells/mL，取200μL细胞悬液加入Transwell小室的上室，24孔培养板下室内加入600μL含10% FBS培养基。注意下层培养液与小室之间不要有气泡；培养板置于37℃的CO2培养箱，培养72h；取出小室，PBS清洗2次，用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，在24孔板内4%多聚甲醛固定20min，结晶紫溶液染色15min；倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数10个视野，取平均值，统计分析。

1.8 细胞划痕实验Marker笔在6孔板背后，用直尺均匀划横线，大约每隔0.5～1cm划一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线，在孔中加入约5×105个细胞，过夜能铺满即可，第二天用枪头沿着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入37℃、CO2培养箱，按12h、24h、48h取样，拍照。

1.9 统计学方法全部数据用SPSS 22.0统计软件计算各组的均值和标准差(以“均数±标准差”表示)，统计处理采用独立样本t检验和卡方检验。P值反映各组间的差别，P<0.05为有显著性差异。采用GraphPad 8.0软件进行作图。

2 结果

2.1 ABCC1高表达细胞株的建立如图1A所示，荧光显微镜下可观察到重组病毒感染细胞的转染效率在80%以上。重组病毒感染后72h，实时定量RT-PCR结果显示Lv-ABCC1组ABCC1 mRNA表达水平较Lv-Control组和对照组明显增加(P<0.01)，见图1B；Western Blot 结果显示ABCC1蛋白表达在三组之间的水平与ABCC1 mRNA表达水平一致(P<0.01),见图1C。结果说明我们通过慢病毒途径成功建立了ABCC1过表达的BEAS-2B细胞。

图1 ABCC1高表达的BEAS-2B细胞的建立

2.2 ABCC1对BEAS-2B细胞增殖的影响CCK-8实验检测结果显示，Lv-ABCC1组细胞增殖活性较Lv-Control组与对照组BEAS-2B细胞明显增强(见图2A，P=0.002)；流式细胞周期分析表明，Lv-ABCC1组细胞进入S期的比例较Lv-Control组与对照组BEAS-2B细胞明显增加(见图2B，P=0.004)。以上结果说明ABCC1促进BEAS-2B细胞的增殖。

图2 ABCC1促进 BEAS-2B细胞的增殖

2.3 ABCC1对BEAS-2B细胞侵袭和迁移能力的影响Transwell侵袭实验结果显示，Lv-ABCC1组细胞穿过Matrigel基质胶及滤膜的细胞数明显增加，说明Lv-ABCC1组细胞侵袭能力较Lv-Control组与对照组明显增强(见图3A，P=0.002)。细胞划痕迁移实验结果显示,Lv-ABCC1组细胞迁移能力较Lv-Control组与对照组BEAS-2B细胞明显增强(见图3B)。以上结果说明，ABCC1促进BEAS-2B细胞的侵袭和迁移。

图3 ABCC1促进 BEAS-2B细胞的侵袭和迁移能力

3 讨论

ABCC亚家族属于ABC转运蛋白超家族7个亚家族之一，ABCC1是ABCC亚家族第一个被发现的成员，亦是ABC转运蛋白家族第二个被发现的成员。它分布于体内几乎所有组织，可以转运多种不同底物，如药物、重金属离子、机体代谢毒物、谷胱甘肽、葡糖醛酸和硫结合物等。目前，多项研究表明ABCC1是肿瘤细胞产生多药耐药的最主要因素[8-12]，而且ABCC1在表达部位、调控机制和遗传变异上所具有的特点，能够使其成为理想的肿瘤生物标记物、成为可以量身定制的化疗靶点和可以成为操控肿瘤细胞对药物敏感性的治疗靶点，因此关于ABCC1的研究具有极大的吸引力。

ABCC1高表达见于多种肿瘤组织，例如肺癌[13]、乳腺癌[14]、直肠癌[15]和胰腺癌[16]等，然而ABCC1在肺癌的表达与患者预后的关系却有截然不同的结论,Li J等人[17]的研究显示ABCC1表达与非小细胞肺癌患者的无瘤生存率和总体生存率相关，而Merk[18]和Filipits[19]等人的研究则显示ABCC1表达与非小细胞肺癌患者的总体生存率不相关，对此，KunickT[8]认为造成这种争议可能与研究方法有关，如免疫组化抗体的选用，研究人群的种族或治疗方案差异造成研究可信度不足和发生偏倚。

ABCC1的功能研究并不完整。ABCC1表达的调控研究和翻译后加工机制知之甚少，特别是ABCC1启动子区域的表观遗传因素实际上还未见相关研究。目前，对ABC转运蛋白与经典的促癌和抑癌信号通路间的互作研究关注不足，导致ABCC1功能研究不完整，特别是ABCC1是否也像家族其他成员如ABCG2等一样，具有促进肿瘤细胞增殖和转移作用，鲜有相关报道，其调控网络亦不完整。本实验通过慢病毒途径(Lv-ABCC1)感染BEAS-2B细胞，结果显示，ABCC1高表达可使人正常肺上皮细胞BEAS-2B的增殖活性明显增强，使细胞进入S期的比例明显增加，细胞的侵袭和迁移能力明显增强。

由此可见,ABCC1能够显著增加BEAS-2B细胞的增殖、侵袭和迁移能力，促进BEAS-2B细胞的恶性转化。本研究对ABCC1具有促进肿瘤细胞增殖和转移作用进行了探讨，将为该方向的研究提供基础的实验资料。