CA199、CEA及cfDNA的联合检测对胆管癌的辅助诊断价值

莫 迪,李梦雨，李华洋，王志龙，李丽娟，金 红

(牡丹江医学院1.第一临床医学院；2.附属红旗医院检验科；3.附属红旗医院质控科；4.研究生处；5.附属红旗医院病理科，黑龙江 牡丹江 157011)

胆管癌是在癌症患者中仍然被认为是一种罕见的消化系统恶性肿瘤，发病率大约为1%[1]。胆管癌辅助诊断的实验室常规检测指标为传统的肿瘤标志物(包括CA199和CEA等)，但是单独检测的诊断敏感性和特异性较低。而现在液体活检技术正在迅速发展并广泛应用于临床，是一种通过检测患者的血液、脑脊液、尿液、胸膜腔液和腹水等液体中的生物标志物的检验手段。其中血液标志物包括：cfDNA、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)、外泌体(exosomes)等[3]。其中cfDNA被称作循环游离DNA，是指由正常细胞凋亡或肿瘤细胞坏死而释放入体循环中的游离DNA。通常肿瘤患者血浆的cfDNA水平要远高于正常人，人们通过定量检测血浆的cfDNA判断患者是否存在肿瘤。与传统肿瘤标志物相比较，这些血液标志物对多种癌症的早期诊断具有较高的诊断效能，可以实时的动态监测癌症患者的治疗效果和预后情况等。

由于单一的肿瘤标志物对胆管癌的诊断尚缺乏足够高的敏感性和特异性，因此，我们联合检测血液中的与胆管癌相关的肿瘤标志物糖类抗原(CA199)、癌胚抗原(CEA)和血浆游离(cfDNA)的水平，旨在探讨其是否提高胆管癌的诊断效率。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 纳入标准 胆管癌组和良性胆管疾病组：(1)根据主要临床症状有腹部不适、胀痛、乏力、上腹肿块、黄疸、发热和消瘦，血液检验肝功指标异常，影像学检查证实胆管存在病变者，包括胆管肿瘤、胆管结石、胆管囊肿等；(2)胆管癌患者术前未接受任何化疗、放疗及生物治疗等；(3)经过手术或超声介导的细针穿刺病理检查诊断为胆管癌和良性胆管疾病。健康人组为与胆管癌组和良性胆管疾病组为同时期健康体检者。

1.1.2 排除标准 (1)全身其他系统或器官良、恶性肿瘤；(2)存在严重的心脏、肝脏、肾脏等功能问题；(3)由其他恶性肿瘤转移的胆管癌患者；(4)经手术病例未证实为原发性胆管癌；(5)术前接受过放疗或化疗,近期接受免疫抑制治疗等；(6)全身情况差不耐受手术者；(7)有严重的凝血功能障碍和出血风险的患者；(8)合并其他严重的肝胆消化系统疾病，如肝硬化，胰腺炎等；

1.1.3 一般资料 根据纳入和排除标准，收集2018年1月至2019年8月间哈医大附属肿瘤医院及牡丹江医学院附属红旗医院的85名胆管疾病患者。按病理结果分组，胆管癌组共45例，男29例，女16例，平均年龄为(63.4±15.2)岁，均为腺癌，其中高分化者共3例，中分化者31例，低分化者11例；良性胆管疾病组40例患者，男性22例，女性18例，包括胆管结石29例，胆管囊肿11例，平均年龄为(59.3±13.6)岁。健康人组45人，男性23例，女性22例，平均年龄为(58.2±14.3)岁。三组性别、年龄分布无统计学差异。本研究严格按照赫尔辛基宣言,经医学伦理委员会批准，所有纳入研究的人员均自愿签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器全自动微粒子化学发光仪(i2000)购于美国雅培公司，实时荧光定量PCR仪(ViiATM 7 Real-Time PCR System)购于美国ABI公司，糖类抗原199定量测定试剂盒(化学发光微粒子免疫分析法)和癌胚抗原定量测定试剂盒(化学发光微粒子免疫分析法)购于美国雅培公司，血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，人GAPDH引物基因购于上海生工生物工程股份有限公司，人类基因组DNA购于美国Promega公司。

1.3 检测方法

1.3.1 血液标本采集与前处理 采集患者清晨空腹的肘静脉血，获得血清及血浆。

1.3.2 CA199和CEA的检测 使用全自动微粒子化学发光仪(美国雅培i2000)进行定量检测三组人群的测待样本血清的CA199和CEA水平。

1.3.3 cfDNA的检测 采用实时荧光定量PCR定量检测cfDNA水平。使用血清/血浆游离DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取血浆中的cfDNA，储存在-20℃冰箱。使用针对cfDNA上稳定存在的管家基因GAPDH基因为引物(上海生工生物工程股份有限公司)，人类基因组DNA作为标准品，按1∶10、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800进行梯度稀释制作标准曲线。提取的DNA样本一次冻融后，使用实时荧光定量PCR仪进行扩增反应，反应条件设置如下：95℃3min、95℃3s、60℃30s，共40个循环。反应完成后，根据得到的Ct值，带入标准曲线，计算出相应的DNA含量。

1.4 统计学方法使用SPSS 16软件处理与分析数据。采用K-S法进行正态性检验，符合非正态性分布的计量资料使用中位数(M)和四分位间距(P25，P75)表示，组间两两比较采用Mann-Whitney U检验比较。计数资料以频数和百分比(n，%)表示，使用卡方检验进行组间比较。绘制单独检测三种血液标志物的ROC曲线，二元Logistic回归方程计算出三种血液标志物联合检测的概率值，绘制联合检测的ROC曲线，AUC组间差异的比较使用Z检验，计算约登指数确定cfDNA的cut-off值。以P<0.05被视为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组的CA199、CEA及cfDNA表达水平的比较胆管癌组患者血清CA199和cfDNA水平均明显高于良性胆管疾病组和正常对照组，有统计学差异(P<0.05)。而胆管癌组CEA水平与良性胆管疾病组和正常对照组相比较，无统计学差异(P>0.05)。详见表1。

表1 三组血液标志物浓度及比较[M(P25，P75)]

2.2 单独检测和联合检测的ROC曲线联合检测CA199、CEA和cfDNA对胆管癌诊断的敏感性和特异性高于单独检测，差异具有统计学意义(P<0.05)。三项指标联合检测的AUC最大，AUC为0.903。通过计算约登指数得出cfDNA的cut-off值为18.06ng/mL。详见图1、表2。

图1 三种血液标志物单独检测和联合检测的ROC曲线

表2 三种标志物单独检测和联合检测诊断胆管癌的敏感性和特异性(%)、AUC

2.3 患病组血液标志物的阳性数和阳性率的比较按照CA199和CEA已知的参考值和经过ROC曲线计算出的cfDNA的cut-off值，胆管癌组和良性胆管疾病组各组的阳性数和阳性率如表3。胆管癌组与良性胆管疾病组相比较CA199、CEA和cfDNA的阳性数和阳性率均明显升高，具有统计学意义(P<0.01)。

表3 两组的CA199、CEA和cfDNA的阳性数和阳性率[n(%)]

3 讨论

CA199是一种糖蛋白抗原，是目前公认的胆管癌最为有效的诊断和检测预后的肿瘤标志物[4]。已有研究表明胆管癌术前CA199高水平是独立预后不良因素[5]，并且对于诊断胆管癌的灵敏性也有较高水品。CEA是一种蛋白质类肿瘤标志物，由于器官定位较差，好发于不同部位的肿瘤患者血清CEA均有不同程度的增高[6]。并且有研究表明胆管癌细胞可以产生CEA，单独检测血清中的CEA的诊断灵敏性和特异性均不高[7]，临床中CA199和CEA已被广泛应用于胰腺癌、胆管癌及其他消化系统肿瘤的诊断和监测疗效和预后。因此，要和其他肿瘤标志物联合检测来提高对胆管癌的诊断效率。cfDNA被称为是循环游离DNA，是一种存在于体液中的游离DNA[8]。我们的研究中主要是研究了在血浆中存在的血浆游离DNA含量。血浆游离DNA(cfDNA)是一种由于细胞凋亡、坏死和/或被巨噬细胞消化而释放入血液的游离DNA[9]。这种利用检测癌症患者血浆中的cfDNA作为恶性肿瘤的诊断、检查治疗效果和判断预后的手段被称为液体活检[10]。液体活检被认为是一种无创且对于肿瘤的早期诊断有很高的灵敏性和特异性的检测手段。并且大量研究表明，恶性肿瘤患者,如肺癌、结直肠癌和乳腺癌等患者的血浆cfDNA含量均明显高于健康人[11-13]。但是在胆管癌中鲜有探讨，本研究检测了胆管癌患者血浆中的cfDNA，计算其单独检测的诊断灵敏性和特异性，并且评价了CA199、CEA和cfNDA联合检测是否提高了诊断敏感性和特异性。

本研究结果表明，胆管癌组分别与良性胆管疾病组及健康人对照组相比较CA199和cfDNA水平均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。而胆管癌组的CEA水平和良性胆管疾病组和正常对照组相比有升高，但差异不具有统计学意义(P>0.05)。苏德望[14]等报道，检测74例胆管癌患者血清CA199和CEA的水平均明显高于良性胆管疾病组(60例)和健康人组(60例)，差异具有统计学意义(P<0.05)，与本研究的结果不一致，可能是由于研究的胆管癌患者不同总体间的差异，收集的胆管癌患者的CEA低水平较多，中位数和四分位间距与良性组和对照组相差不多，可以通过提高样本量再做统计分析。以胆管癌组和良性胆管疾病组为研究对象绘制了三种肿瘤标志物单独和联合检测的ROC曲线，得到了3种肿瘤标志物的诊断胆管癌的灵敏性、特异性和AUC，从本研究结果显示，CA199单独检测时对胆管癌的诊断灵敏性最高，为84.4%，AUC为0.864；CEA单独检测时的诊断灵敏性和特异性均不是很高，为51.1%和77.5%，AUC为0.661；cfDNA单独检测的灵敏性不是很高，但是它的诊断特异性很高，为95.0%，AUC为0.759。通过Logistic回归建立三种标志物联合诊断的回归模型，通过模型算出的概率值来绘制ROC曲线，发现联合检测的敏感性和AUC均高于各肿瘤标志物单独检测的值，特异性除了低于cfDNA的单独检测结果，均高于单独检测CA199和CEA的特异性结果。但是有研究者发现，胆管癌患者胆汁中的CA199和CEA联合检测也可以提高诊断效率，并且检测胆汁中的CA199和CEA水平对胆管癌的诊断优于检测血清中的这两项指标[15]。

综上所述，胆管癌患者的血清CA199、CEA和血浆cfDNA均呈较高水平，联合检测这三种肿瘤标志物也具有较高的诊断敏感性和特异性，为诊断胆管癌提供重要的参考。