河源地区机采血小板固定献血者血小板抗原系统基因多态性分析

欧小懂 叶登凰 黄 璐 黄仕云 陈勇芳 邱美丽

河源市中心血站(河源 517003)

人类血小板同种抗原(human platelet alloantigen，HPA)是分布在血小板糖蛋白上一类特异性抗原，又称血小板特异性抗原。HPA 属于双等位共显性遗传系统，分别位于第 5、6、17、22 号染色体上的 6 个遗传位点。因其核苷酸碱基缺失或单核苷酸多态性替换导致相应位置单个氨基酸的变异[1]，表现血小板独特的遗传多态性[2]。研究已证实 HPA 多态性分布存在种族差异[3]和地域差异[4]，同时与血小板输注无效(PTR)、输血后血小板减少性紫癜(PTP)等疾病相关。从2009年起我国开始推进机采血小板献血者HPA 基因库的建立，主要集中在各省血液中心，建设规模普遍不大，覆盖面有限。建立地方血站HPA 基因库，对解决本地区长期需要机采血小板治疗的患者的输注无效问题具有重要意义。HPA基因分型方法、检测指标及血小板基因库规模缺乏统一标准，各血站采用的试剂盒、引物未经过权威部门室间质评验证，难以保证结果的一致性。目前HPA基因分型方法主要采用聚合酶链反应核苷酸特异性引物技术、聚合酶链反应序列特异性寡核苷酸探针技术、核苷酸序列测定法等。HPA检测指标在各个血站存在差异，如检测 HPA 1- 6，15、HPA 1-17w、HPA 1- 21w。本研究主要采用聚合酶链反应核苷酸特异性引物技术(PCR-SSP)方法分析河源地区机采血小板固定献血人群HPA1～17系统的基因多态性，为建立本地区HPA分型机采血小板供血者库奠定基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象

随机选择河源市中心血站机采血小板固定献血者100例为研究对象，年龄为18～50周岁(中位年龄为29周岁)。所有研究对象在本血站近两年内捐献机采血小板至少3次，并签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂

人类基因组DNA提取试剂由北京天根生化科技有限公司提供；HPA基因分型试剂由天津市秀鹏生物技术开发有限公司提供；扩增仪由美国ABI7500提供；电泳仪北京君意东方电泳设备有限公司提供。

1.3 人类血小板同种抗原 HPA1～17基因分型

1.3.1 人类全血基因组DNA提取 取400 μL抗凝血，严格按照说明书操作要求，收集DNA溶液至离心管中，保存- 80 ℃冰箱备用。要求：DNA使用最佳浓度为30～50 ng/μL，A260/A280值为1.6～2.0。

1.3.2 PCR扩增 采用PCR-SSP方法，每人份34个孔位，每个孔位反应体系： BUFFER(含引物) 320 μL +Taq酶3.3 μL+DNA50 μL 。再加入 15～20 μL石蜡油。将封板膜重新覆上反应板置于PCR 仪样本槽相应位置，并记录放置顺序。 按表1参数设置，进行PCR扩增。

表1 PCR扩增运行参数

1.3.3 凝胶电泳成像 将每个PCR反应产物(10 μL)转移到 2.5%琼脂糖凝胶孔中。电泳参数：电压：140～150V；时间：15～20 min(内参带与阳性带清晰分开时即可停止电泳)。紫外凝胶成像系统下观察结果并拍摄成像，保存试验结果。

1.4 统计学方法

采用基因计数法计算基因频率。基因频率f(a)或f(b)=基因数f(a)或 f(b)/该基因的等位基因总数。杂合度频率f(ab)=杂合子f(ab)/该基因的等位基因总数。不配合率= f(ab)×[1- f(a)×f(b)]。采用χ2检验分析基因型观察值与期望值是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡。

2 结 果

2.1 等位基因电泳结果

100例机采血小板固定献血者获得 HPA 1～17基因扩增产物凝胶成像图，主要为aa表型。HPA- 2、HPA- 3、HPA- 5、HPA-15系统具有多态性并存在aa、ab、bb3种表型。其中2个样本 HPA 基因检测结果为：1aa2aa3ab4aa5aa6aa15bb7aa8aa9aa10aa11aa 12aa13aa14aa16aa17aa，见图1(含3ab、15bb)；基因分型结果为：1aa2aa3aa4aa5aa6aa15ab7aa8aa9aa 10aa11aa12aa13aa14aa16aa17aa，见图2(含15ab)。

图1 HPA1～17等位基因电泳图

图2 HPA1～17等位基因电泳图

2.2 HPA1～17等位基因频率

100例机采血小板固定献血者HPA1～17基因中成多态性分布的等位基因是HPA2a、HPA3a、HPA5a、HPA15a，其频率分别为0.96、0.49、0.99、0.515。HPA1a、HPA4a、HPA6a-14a、HPA16a、HPA17a基因频率为1，呈单线性分布，未发现b基因。见表2。

表2 无偿献血者HPA1-17等位基因分布结果

3 讨 论

血小板输注是预防和改善因血小板减少或血小板功能障碍引起出血的重要治疗手段[5]。随着临床输血技术的快速发展，血小板的临床应用日益增多，血小板输注过程中所产生的问题特别是血小板输注无效[6]的问题亦日益突出。 目前国际上用于 PTR 患者血小板供者筛选的方法主要有两种：基于 HLA/HPA 特异性配型原则的筛选和基于交叉配合试验的筛选[7]。 对于血小板抗体筛选阳性的PTR 患者，HLA/HPA 配型可显著提高血小板交叉试验阴性率，提高血小板输注治疗效果。2003年，血小板命名委员会对HPA进行了系统命名。目前已有23个血小板同种抗原被正式命名[8]。在该抗原遗传系统中，2个等位基因用a和b表示。分别代表基因频率大于50%(a)和小于50% (b)。

本研究通过对100 名机采无偿献血者HPA-1～17系统研究，各系统均符合H-W遗传平衡定律，说明检测结果可靠。HPA- 2、HPA- 3 及HPA-15 是杂合度较高的3 个系统，与国内大部分报道一致[9-10]。HPA- 3的抗原位于糖蛋白GPⅡb上，其多态性是因为编码位点上的一对碱基G-T被置换，分别为HPA- 3b和HPA- 3a。本研究对象HPA3a基因频率为0.49，与中国2 458名汉族人群(3a基因频率为0.558 6)[9]比较差异无统计学意义(χ2=0.393，P=0.531)。HPA系统中a、b不配合概率反映HPA在血小板输注时刺激宿主的免疫系统产生血小板同种抗体概率。不同血小板抗体在导致同种免疫血小板减少症中出现的概率也就不同。本研究对象中HPA- 3系统中b基因频率大于50%，不配合率最高(0.420)，HPA-15系统次之，与赵毓宏[11]报道的浙江地区人群不完全一致，其原因可能为本研究对象仅局限于机采血小板固定献血者或者两者存在地域差异。陈鑫苹[10]曾报道海南地区黎族机采血小板献血者HPA- 3b(0.511)、HPA- 15b(0.575)的基因频率偏高。本研究结果显示HPA- 15b基因频率显著低于黎族机采血小板献血者，HPA- 3b基因频率无显著差异。上述差异提示发生血小板输注无效时，应注意HPA- 3、15基因系统的配合性输注，尤其是aa、bb纯合子的受血者。其它系统不配合率很低或等于 0，血小板免疫性反应的危险亦低。目前国内部分血站开始建立一定规模的单采血小板献血者HPA 基因数据库[12]，联合大型医院建立有效的输血策略实现供患者间HPA 基因型特异性配合[13]，尤其是对已产生血小板特异性抗体的多次献血者，取得良好的输注效果[14]。随着人们对血小板血型研究的逐步深入、PCR技术逐渐成熟以及DNA 序列的研究逐步明晰，大规模的HPA自动化基因分型技术和第五代芯片技术即将成为常规分型方法。各级血站建立和完善已知HPA基因型的血小板供者库，对于需多次输血的血液病患者输注血小板从第 1 次开始就选择ABO 血型相合，HPA交叉配型亦相合的单一供者的血小板输注[15]，为有效解决血小板输注无效提供有利的平台。本研究中100例机采血小板固定献血者献者均可应患者需求随时待命、即招即采，基本满足本地区机采血小板临床需求。充分利用本地区机采血小板供血者库信息,为患者减少血小板输注无效难题将是本课题下一步的研究的重点。