狗枣猕猴桃AkMYB5基因的生物信息学分析

刘丹 李然红 陈鑫

摘要：为研究狗枣猕猴桃[Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.]AkMYB5的功能，利用生物信息学工具和方法，对其编码蛋白质的理化性质、亲水/疏水性、跨膜结构、结构功能域、二级结构、三级结构、蛋白质修饰位点及同源性等进行分析和预测。结果表明，AkMYB5的cDNA全长为1 339 bp，CDS为1 053 bp，编码蛋白由351个氨基酸构成的亲水性非稳定蛋白，属于MYB5蛋白家族（PLN03212），主要构件为α-螺旋和不规则卷曲，与其他18种植物的MYB氨基酸序列进行比对发现，其与中华猕猴桃变种（Actinidia chinensis var. chinensis）AkMYB5的亲缘关系较近。

关键词：狗枣猕猴桃[Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.];AkMYB5;生物信息学

Abstract： To obtain information about AkMYB5 gene from Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.，the bioinformatics methods and tools were used to analysis the physical and chemical properties， hydrophilicity/hydrophobicity， transmenbranne domain，structure and function domain ，secondary structure，tertiary structure， protein modification sites and homology of MYB5 from Actinidia kolomikta. The results showed that the length of AkMYB5 cDNA was 1 339 bp and the coding area was 1 053 bp coding 351 amino acid. AkMYB5 was a unstable and hydrophilic protein belonging to the MYB5 superfamily （PLN03212）. The analysis also demonstrated that AkMYB5 main component was Alpha-helix and random coil. Compaired to MYBs of the other 18 plants， AkMYB5 had near relationships with Actinidia chinensis var. chinensis.

Key words： Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.; AkMYB5; bioinformatics

狗棗猕猴桃[Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.]别名深山木天蓼、狗枣子，猕猴桃属大型落叶藤本植物，主要分布于中国东北三省、四川、云南等针叶混交林地。狗枣猕猴桃是最为耐寒的猕猴桃品种之一，是良好的抗寒育种资源，在生长发育过程中叶片颜色会发生动态变化，形成绿、白、粉、浅红和紫红的斑状彩叶，其果实柔软多汁、酸甜可口、维生素C含量较高，是一种药食观赏兼用植物[1-3]。植物的MYB蛋白能够参与植物的生长发育、生长调节因子的信号传导、抗逆性的调控、花青素的代谢等功能，是植物抗逆应激反应及发育调控的关键蛋白[4]。MYB作为植物中最大的转录因子家族之一，首次在玉米中被发现，随后在许多植物中均被分离和鉴定，如拟南芥、百合、草莓、当归、枸杞、烟草、棉花、水仙等，研究结果证明MYB对非生物胁迫应答响应起着重要作用[5-7]。Cominelli等[8]发现MYB能够参与调控拟南芥的气孔运动、细胞扩张及角质层的沉积以参与抗旱性。另外，MYB参与植物花青素的合成代谢，陈江等[9]研究表明在红花的根、茎中MYB表达量较低，在花中表达量较高;MYB同时参与苹果、梨、草莓、桑葚等果实的花青素合成[10]。本试验以狗枣猕猴桃转录组数据为参考，筛选到AkMYB5的cDNA序列，利用生物信息学方法对其理化性质、疏水性/亲水性、蛋白质结构功能域、二级结构、三级结构、蛋白质修饰位点及同源性等方面进行预测和分析，以期为狗枣猕猴桃AkMYB5功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

狗枣猕猴桃AkMYB5的cDNA序列从作者所在实验室转录组数据中获得;葡萄（Vitis vinifera，RVW46342.1）、胡桃（Juglans regia，XP_018820139.1）、中华茶花（Camellia sinensis var. sinensis，THF94188.1）、中华猕猴桃变种（Actinidia chinensis var. chinensis，PSS10299.1）、茶树（Camellia sinensis，XP_028093628.1）、可可树（Theobroma cacao，XP_007025822.2）、哥伦比亚锦葵（Herrania umbratica，XP_021293847.1）、烟草（Nicotiana attenuata，XP_019229348.1）、榴莲（Durio zibethinus，XP_022777375.1）、欧洲栓皮栎（Quercus suber，XP_023877052.1）、土瓶草（Cephalotus follicularis，GAV67420.1）、树棉（Gossypium arboreum，XP_017605289.1）、木薯（Manihot esculenta，XP_021596793.1）、毛果杨（Populus trichocarpa，XP_002305647.1）、麻疯树（Jatropha curcas，XP_012091477.1）、棉花（Gossypium hirsutum，XP_016726789.1）、柿子（Diospyros kaki，AKP06176.1）、白桦（Betula platyphylla，QBX99292.1）等植物氨基酸序列在NCBI数据库中下载。

1.2 方法

狗枣猕猴桃AkMYB5蛋白的理化性质用ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam）进行分析;采用NCBI-CDD进行保守结构域及蛋白家族预测（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）;采用Inter-ProtScan（http：//www.ebi.ac.uk/ interpro/search/sequence-search）预测功能位点;采用NetOGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/）对O-糖基化位点进行预测;采用 SOPMA 及PredictProtein 数据库（https：//www.predictprotein.org/）对AkMYB5蛋白进行二级结构及蛋白质修饰位点预测;使用 SWISS-MODEL（http：//swissmodel.Expasy.org/）在线软件预测蛋白质三级结构。从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中获得18条不同植物的MYB氨基酸序列信息，利用MEGA5.1软件的Neighbor-joining法构建蛋白质系统进化树。

2 结果与分析

2.1 AkMYB5蛋白理化性质预测

利用ProtParam软件对狗枣猕猴桃AkMYB5序列进行分析，结果表明，AkMYB5基因cDNA全长为1 339 bp，编码区（CDS）为cDNA上第200～1 252个碱基，共编码351个氨基酸，编码蛋白质分子质量为39 699.45 u，理论等电点为5.87，负电荷残基总数（Asp+Glu）为36，正电荷残基总数（Arg+Lys）为31，分子式为C1741H2701N489O546S15，总原子数5 492，不稳定指数为46.81，脂肪系数（Aliphatic index）为72.54，亲水性（GRAVY）的平均水平为-0.585。这说明该蛋白为亲水非稳定性蛋白。该蛋白中含量最多的为丝氨酸，占11.7%;其次为亮氨酸和天冬酰胺，各占10.3%和9.4%;含量最少的为色氨酸占1.7%;吡咯赖氨酸及硒半胱氨酸含量为0（图1）。通过ProtScale软件分析预测，该基因蛋白的整个肽链中均含有亲水性和疏水性氨基酸，得分最大为1.722，在第169个氨基酸处，最小为-2.222，在第17个氨基酸处;从整体分布看，氨基酸的负值多且分值大（图2），根据蛋白质亲水和疏水的得分判定该蛋白为亲水蛋白。

2.2 AkMYB5信号肽和跨膜结构

信号肽常指多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的特殊氨基酸序列，长度在5～30個氨基酸，包含信号肽的C端、N端和疏水核心区。SignalP-4.1预测AkMYB5蛋白不含信号肽（图3），同时不存在跨膜结构（D-cut off为0.450<0.5）。

2.3 AkMYB5结构域预测

通过NCBI-CDD氨基酸序列的比对，对AkMYB5保守序列及其蛋白家族进行预测，结果表明，AkMYB5是MYB基因家族的成员（PLN03212），其第5～128氨基酸之间的序列区域为MYB5组的保守结构域，并同时含有SANT保守结构（图4）。

2.4 AkMYB5蛋白二级、三级结构预测

使用SOPMA对AkMYB5蛋白的二级结构进行分析预测，结果显示，该蛋白33.33%可能会形成螺旋（Helix），7.12%可能形成延伸链（Strand），3.42%可能形成转角（Turn），56.13%为无规卷曲（Random coil），无二硫键的形成，没有特殊的二级结构（图5）。用SWISS-MODEL对AkMYB5蛋白进行三级结构的预测，结果如图6所示。

2.5 蛋白质修饰位点的预测

蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制，蛋白质的N-糖基化修饰是生物体调控蛋白质在组织和细胞中的定位、功能、活性、寿命和多样性的一种普遍的翻译后修饰。通过PredictProtein对N-糖基化位点进行预测，该蛋白内有6个潜在的N-糖基化位点，分别在150（NLSR）、209（NQSQ）、252（NFSE）、264（NLSK）、292（NFSF）及317（NSSS）氨基酸处。O-糖基化是另一种重要的蛋白质翻译后修饰，O-糖链能维持所连接蛋白质部分的空间构象。采用NetOGlyc4.0 server对O-糖基化位点进行预测，预测分数均大于0.5的认为是阳性，故推测该蛋白内含38个O-糖基化位点。Predict Protein预测分析结果见表1，可知AkMYB5含有6个糖基化位点（N-glycosylation site）、5个酪蛋白磷酸激酶Ⅱ磷酸化位点（Casein kinase II phosphorylation site）、5个十四烷酰化位点（N-myristoylation site）、1个酪氨酸激酶磷酸化位点（Tyrosine kinase phosphorylation site）、3个蛋白激酶C磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylation site）、1个ATP/GTP结合位点（ATP/GTP-binding site motif A （P-loop））序列。

2.6 氨基酸序列同源性对比

在NCBI数据库中分别下载葡萄、胡桃、中华茶花、中华猕猴桃变种、茶树、可可树、哥伦比亚锦葵、烟草、榴莲、欧洲栓皮栎、土瓶草、树棉、木薯、毛果杨、麻疯树、棉花、柿子、白桦18种植物的MYB氨基酸序列，与狗枣猕猴桃AkMYB氨基酸序列进行同源性分析，结果表明，狗枣猕猴桃AkMYB氨基酸序列与中华猕猴桃原变种亲缘关系较近，而与葡萄、中华茶花等植物亲缘关系较远（图7）。

3 讨论

MYB直接或间接参与植物的生长发育、花青素合成、逆境响应及信号调节等生理生化过程。目前已经从多种植物中克隆到MYB基因包括拟南芥、烟草、白桦、棉花、矮牵牛等，并在类黄酮化合物合成中发挥重要作用。本研究利用已测的狗枣猕猴桃转录组数据，筛选出狗枣猕猴桃MYB基因cDNA序列信息，并对其进行了生物信息学分析。结果表明，AkMYB5基因cDNA全長为1 339 bp，编码区（CDS）为cDNA上第200～1 252个碱基，共编码351个氨基酸，是MYB5（PLN03212）家族的一员，属于亲水性、非稳定的蛋白，蛋白中丝氨酸、亮氨酸和天冬酰胺含量较高，没有跨膜结构。在NCBI数据库中对AkMYB5进行Blast，结果显示，与狗枣猕猴桃MYB序列一致性最高的为96.30%，最低的为54.55%。选取18条氨基酸序列与AkMYB5蛋白进行比对，经MAGA5.1分析，AkMYB5蛋白与中华猕猴桃原变种亲缘关系较近，而与葡萄、中华茶花等植物亲缘关系较远。以上结果为进一步研究狗枣猕猴桃AkMYB5基因功能提供了一定的理论基础。

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