补阳还五汤对SCII模型大鼠细胞自噬相关蛋白影响的研究*

★ 郭晓辉 卜保献 李艳侠 耿捷 李寒曦（河南省洛阳正骨医院/河南省骨科医院 河南 洛阳 471002）

脊髓缺血再灌注损伤（SCII）是指脊髓受压缺血，经过减压后血液重新回流，出现神经损伤加重的情况［1］。补阳还五汤对于急性脊髓损伤方面的研究较多，但是对于脊髓缺血再灌注损伤细胞自噬方面的研究较少。基于此，考虑将传统中药与脊髓缺血再灌注损伤相结合，从细胞自噬方面进行研究，探讨自噬发生的机制规律，尝试运用补阳还五汤干预细胞自噬，为中药治疗神经细胞损伤提供一种新的思路。

1 资料与方法

1.1 实验动物 SPF级2月龄大鼠（SD）48只，雌雄各半，购于山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（晋）20150001，重量在230～250 g，分笼喂养。室温在20℃～ 22℃，相对湿度45%～50%，12 h光暗循环，喂食过滤水和营养饲料。实验过程及方法符合河南省洛阳正骨医院实验动物伦理委员会要求。

1.2 主要药物、仪器及试剂 补阳还五汤（黄芪120 g，当归6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g。上述药物购于河南省洛阳正骨医院，并由该院制剂室加工成1mL汤药含生药4g，即4 g/mL质量浓度，无菌封瓶，-20℃冰箱保存备用）；病理切片机（德国Leica RM 2016轮转式切片机）；脱水机（武汉俊杰JT-12J电脑生物组织脱水机）；组织摊烤片机（武汉俊杰JK-6生物组织摊烤片机）；显微镜（奥林巴斯BX53型生物显微镜）；无水乙醇（国药集团，批号10009218）；苏木素（Sigma，批号H9627）；包埋石蜡（国药集团，批号69019361）；Beclin 1（兔）（武汉三鹰，批号11306-1-AP）；P62（兔）（武汉三鹰，批号18420-1-AP）；LC3（兔）（武汉三鹰，批号14600-1-AP）。

1.3 实验分组、干预及造模 48只大鼠采用完全随机数字法分组，随机分为：假手术组、模型组、观察组和3-MA组，每组12只。每组在缺血再灌注后3 h、6 h相应分为2组，每小组6只。按照大鼠的重量，腹腔内注射配置好的氯胺酮注射液（配置标准：10 mg/kg）。大鼠按照文献［2］进行造模：腹部正中切开，逐层切开，到达腹腔后，把肠管拉向右侧，温盐水敷料覆盖，找到左肾动脉与腹主动脉，在左肾动脉下约1 cm处用动脉夹闭腹主动脉。计时40 mim后，开放腹主动脉。再灌注时间以松夹瞬间开始计算。假手术组：分离出腹主动脉后，根据余组夹闭时间确定腹腔内注射0.9%的生理盐水1 mL。模型组：分离腹主动脉后，完全夹闭腹主动脉40 min后放开。放开的时候立即腹腔内注射0.9%的生理盐水1 mL。观察组： 在造模的前三天给予制备好的补阳还五汤1 mL灌胃，每天两次，造模过程同上。3-MA组：腹腔注射按照剂量为15µg/g比例配置的3-MA注射液，然后完全夹闭腹主动脉，夹闭腹主动脉40 min后开放。

1.4 取材 ①缺血再灌注3 h、6 h后观察各组大鼠活动，然后进行行为学评分，再进行腹腔注射麻醉（同前）。②麻醉成功后，切开胸腔，在升主动脉内进行置管，先灌注生理盐水，等到右心房剪开后有清亮液体流出时，换用10%的甲醛再次进行灌注，待大鼠僵硬后，俯卧位固定。背部正中切开，分离椎旁肌，显露出棘突及椎板，然后用小型咬骨钳咬除，暴露出硬膜囊。③用锋利刀片先将脊神经切断，然后分离出L2-5段脊髓，迅速将两端切断，分为两部分。一部分浸泡于10%福尔马林溶液内，另一部分存放于-80℃冰箱内。

1.5 大鼠脊髓损伤后行为学评价 在缺血再灌注3 h、6 h后进行改良Tarlov行为学评分［3］。改良Tarlov行为学评分：后肢完全瘫痪，无可察觉的后肢活动，0分；后肢轻微移动，但无法对抗重力，1分；后肢可运动，但无法对抗重力，2分；能行走或跳跃，但有明显共济失调，3分；后肢步态正常，能正常跳跃，4分。

1.6 免疫组化检测各组脊髓组织中蛋白 Beclinl 、 LC3、P62的表达情况。

1.7 透视电镜检测细胞自噬情况。

1.8 统计学分析 应用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（）来表达。每组均数比较应用单因素方差分析，各组比较若方差齐性，采用最小显著差法（LSD）；组间比较若方差不齐，采用Dnnett法。设置检验水准为0.05。

2 结果

2.1 SCII后行为学评分比较 假手术组在缺血3 h后与余组比较，行为学评分有统计学意义（P＜0.05），模型组、观察组、3-MA组均存在后侧肢体功能障碍，其中模型组症状最重，而观察组与3-MA组比较，无统计学意义（P＞0.05）。在缺血6 h后，假手术组与模型组、3-MA组比较，行为学评分有统计学意义（P＜0.05），模型组、3-MA组仍存在后侧肢体功能障碍，但是3-MA组症状较轻。而假手术组与观察组比较，无统计学意义（P＞0.05），说明两组症状基本一致。详见表1。

表1 各组大鼠脊髓损伤后行为学评分比较（，n=12） 分

表1 各组大鼠脊髓损伤后行为学评分比较（，n=12） 分

注：与假手术组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05；与3-MA组比较，③P<0.05。

组别 缺血3h 缺血6h假手术组 4.00 4.00模型组 0.67±0.58① 1.33±0.58①观察组 2.63±0.58②③ 3.75±0.58②③3-MA组 2.00±0.21② 3.00±0.19②

2.2 免疫组化检测各组脊髓组织中蛋白Beclinl 、 LC3、P62的表达变化 详见表2。在缺血3 h后，假手术组和余组比较，有统计学意义（P＜0.05），模型组与观察组、3-MA组比较，有统计学差异（P＜0.05）。观察组和3-MA组比较，无统计学差异（P＞0.05）。

表2 各组在缺血3 h后免疫组化积分光密度值（IOD）的比较（，n=12） 分

表2 各组在缺血3 h后免疫组化积分光密度值（IOD）的比较（，n=12） 分

注：与假手术组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05；与3-MA组比较，③P<0.05。

组别 Beclin 1 LC3 P62假手术组 1.571±0.654 2.697±0.500 1.203±0.263模型组 6.595±1.130① 6.866±3.330① 8.309±3.837①观察组 3.300±0.365② 3.533±1.562② 3.605±1.365②③3-MA组 2.838±1.791② 3.498±2.538② 2.912±1.376②

在缺血6h后，假手术组和余组比较，有统计学意义（P＜0.05），模型组与观察组、3-MA组进行比较，有统计学差异（P＜0.05）。观察组和3-MA组比较，有统计学差异（P＜0.05）。详见表3。

表3 各组在缺血6 h后免疫组化积分光密度值（IOD）的比较（，n=12） 分

表3 各组在缺血6 h后免疫组化积分光密度值（IOD）的比较（，n=12） 分

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P<0.05；与3-MA组比较，③P<0.05。

组别 Beclin 1 LC3 P62假手术组 1.327±0.266 2.365±0.095 1.498±0.038模型组 5.577±2.587① 6.735±1.209① 5.915±1.562①观察组 3.610±1.301②③ 3.569±1.126②③ 3.304±1.016②③3-MA组 4.509±1.626② 5.353±2.151② 4.689±1.083②

2.3 透射电镜超微结构结果 假手术组大鼠脊髓组织神经元组织结构基本正常，核型规则为圆形或椭圆形，核膜完整，核内染色质均匀，核仁明显。胞质中细胞器形态分布及数目正常，髓鞘围绕轴索呈同心圆排列，轴索内有微丝和微管，排列规则，未见轴浆变性及颗粒状崩解（详见图a，b）。模型组3 h后、6 h后可见脊髓组织神经元胞浆广泛水肿，线粒体肿胀、空泡化，粗面内质网松散，游离核糖体增多，溶酶体形态不规则，细胞中有大量由单层膜组成的自噬囊泡，其中有高电子密度的吞噬颗粒（即自噬小体）（详见图1c，d）。观察组3 h后髓鞘水肿明显，髓鞘板层围绕轴索呈同心圆排列，轴索内有微丝和微管，排列较紊乱，但未见轴浆变性及颗粒状崩解，线粒体肿胀、空泡化，可见部分自噬小体。观察组6 h后髓鞘水肿明显减退，神经元组织结构基本正常，核型规则为圆形或椭圆形，核膜完整，核内染色质均匀，核仁明显，髓鞘板层围绕轴索呈同心圆排列，轴索内有微丝和微管，排列规则，自噬小体减少（详见图1e，f）。3-MA组3 h后、6 h后髓鞘板层围绕轴索呈同心圆排列，轴索内有微丝和微管，排列较紊乱，线粒体肿胀、空泡化，但未见轴浆变性及颗粒状崩解，未见明显自噬小体（详见图1g，h）。

图1 透射电镜超微结果 （放大倍率5000×）

3 讨论

自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62可反映自噬过程中自噬的发生和强度。本研究中，在缺血3h后、6 h后，模型组、观察组、3-MA组在Beclin1、LC3和 P62三种蛋白的表达方面与假手术组比较有统计学意义（P＜0.05），提示模型组、观察组、3-MA组中三种蛋白的表达均较假手术组上调，其中模型组中Beclin1、LC3和P62三种蛋白的表达上调尤其明显。从行为学上分析，在缺血3 h后、6 h后，除了假手术组外，其余三组大鼠均有后侧肢体功能障碍的的表现，其中模型组最为严重，观察组随着时间的推移，后肢功能障碍症状改善基本达到了和假手术组一致。透视电镜检测发现模型组中自噬小体数量较多，细微结构破坏严重，而观察组自噬小体数量没有模型组多，随着时间的推移，自噬小体数量减少，细微结构也在逐渐的修复中。从以上结果分析可见，模型组中Beclin1、LC3和P62三种蛋白的表达上调最为明显，说明该组发生细胞自噬的情况最为严重，该组的行为学评分与电镜检测的结果也印证了这种情况。而观察组与3-MA组中三种蛋白的表达虽然也有表达上调的情况，但是上调的程度较模型组要小，说明补阳还五汤与自噬抑制剂3-MA可能对Beclin1、LC3 和 P62三种蛋白的表达具有抑制或调节作用，从而影响了细胞自噬过程中自噬的发生与强度。

自噬具有两面性。缺血和再灌注可以引起脊髓神经细胞内自噬的发生，而自噬又是导致细胞损伤、死亡的重要因素［4］。目前研究发现，在中枢神经系统损害或退变过程中，自噬会对神经细胞有保护作用，减少细胞死亡。有研究报道，自噬在器官缺血阶段被激活，通过清除细胞内衰老细胞器及错误折叠蛋白中起重要作用对细胞的保护性作用［5］。另有研究报道，大脑微血管内皮细胞的损伤是血脑屏障被破坏的起始步骤，也是造成缺血再灌注损伤患者预后效果不理想的主要原因，而激活后的自噬可减轻再灌注后大脑微血管内皮细胞的损伤，有益于血脑屏障的完整性，由此推断自噬的存在可以保护神经细胞，避免死亡［6］。自噬是细胞具有的应激与防御机制。自噬可以消化、降解受损、衰老、失能的细胞，给予细胞的再生、重建提供原料，使细胞实现新陈代谢，保护细胞免受损害。另有研究进行报道，过度的自噬会导致自噬性细胞死亡，这种自噬性细胞死亡常常伴随细胞凋亡和细胞坏死的现象，因此有人猜测自噬过度时，有可能会触发细胞的凋亡程序而引起细胞死亡［7］，同时，也有研究认为自噬和细胞凋亡是同时存在的，相互联系与相互制约，自噬性细胞死亡参与了缺血损伤后神经组织的损害［8］。本研究的结果可推测出补阳还五汤与自噬抑制剂3-MA 干预后，可能会对细胞自噬产生促进作用，保护神经细胞，另外对自噬引起神经细胞死亡进行抑制。本研究结果还提示，补阳还五汤与自噬抑制剂3-MA（P＜0.05）在缺血6h后Beclin1、LC3 和 P62等方面比较有统计学意义（P＜0.05），观察组三种自噬蛋白较3-MA组表达降低，是否可以认为补阳还五汤干预优于3-MA？观察组在缺血6 h后电镜检测仍有自噬小体存在，但3-MA组电镜检测未发现自噬小体存在，说明自噬抑制剂已将细胞自噬现象已消除，可能不会对神经细胞死亡进行抑制。SCII后行为学评分提示观察组优于3-MA组（详见表1）。从研究结果分析，补阳还五汤干预优于3-MA组，推测补阳还五汤不仅对细胞自噬进行抑制，保护神经细胞，还可以对神经细胞死亡进行抑制。

补阳还五汤出自清代名医王清任所著的《医林改错》，由生黄芪、川芎、当归尾、地龙、桃仁、红花、赤芍等7味药物组成，诸药合用共奏益气活血通络之功，原本用于气虚血瘀型中风所致半身不遂、口眼歪斜、语言謇涩等症。目前补阳还五汤应用于脊髓损伤方面的研究较多，并且取得了较好的疗效，如可以改善损伤后组织的缺血和炎症反应，抑制细胞死亡，保护神经细胞，促进轴突再生作用，改善损伤后组织水肿等。

通过研究细胞自噬的机制与规律，给予有效的干预，充分利用其有利的一面，避免其不利的一面，保护神经细胞免于凋亡，为神经功能恢复创造良好的条件。补阳还五汤的干预可能会对脊髓缺血再灌注损伤细胞自噬进行双向调节，保护神经细胞。