Box-Benhnken设计-响应面法优化金线莲中多酚的超声辅助提取工艺研究*

★ 郑晓艳 郭月丽（漳州卫生职业学院 福建 漳州 363000）

金线莲为兰科开唇兰属（Anoectochilus roxburghii（wall.）Lindl）植物，新鲜或干燥全草入药［1］，全世界品种超过35种，性喜阴凉、潮湿，大致分布于印度、喜马拉雅山、东南亚各地，野生植株多生长于人迹罕至的原始生态的阴湿森林和草丛中。金线莲株高20-30厘米，叶表面墨绿色，镶嵌以优美的金黄或黄白色条纹，因为被称作“金线莲”。它在民间使用范围较广，素有“药王”“金草”“神药”等美称。归肺、肝、肾、膀胱经，性平，味甘、淡，具有清热凉血、祛风利湿、解毒、止痛、镇咳等功效［2］。金线莲临床上常用于肝炎、支气管炎、肾炎、膀胱炎、糖尿病、小儿急惊风等疾病的治疗［3］。金线莲的主要化学成分，包括有黄酮、多糖、多酚、挥发油、有机酸、甾体、生物碱等［4］。本课题组对金线莲的多糖、总黄酮、多酚提取工艺进行了一系列研究，本文阐述了Box-Benhnken设计-响应面法优化金线莲中多酚的超声辅助提取工艺研究。

本研究运用Box-Behnken中心组合设计优化金线莲中多酚的超声辅助提取工艺，以没食子酸的提取率为指标，选取提取温度、超声时间、料液比和乙醇浓度的四因素三水平的实验模型，建立回归方程，以响应面分析法（RSM）［5-6］对试验结果进行分析，为进一步研究其质量标准、药理活性、作用机制提供一定的参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 超声波清洗仪（型号：KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（型号：T6，北京普析通用仪器有限责任公司公司）；电子分析天平（型号：BS110S/110g，德国塞多利斯有限公司）。

1.2 材料 没食子酸标准品（中国食品药品检定研 究 院，LOT NUMBER：PR190325-11）；Folin-Ciocalteus试剂（三明市三圆化学试剂有限公司，批号：2018080709）；乙醇（三明市三圆化学试剂有限公司，批号：2018030109）所用试剂均为分析纯。金线莲（购于厦门涌泉科技有限公司，经三明市食品药品检验鉴定研究院中药室高忠坂中药师鉴定为正品）

2 方法

2.1 金线莲中多酚的超声辅助提取工艺 准确称取5.0g的干燥的金线莲样品置于具塞锥形瓶中，按料液比加入一定浓度的乙醇溶液，在一定的提取温度超声处理一定时间，冷却至室温，称重，加乙醇溶液补足减失重量，过滤，收集续滤液测定其多酚提取量。

2.2 多酚含量测定

2.2.1 标准曲线的绘制 精密称取没食子酸标准品0.100 g至100 mL容量瓶，乙醇定容至刻度线，得到1mg/mL没食子酸标准储备液。精密量取1 mL没食子酸标准储备液，乙醇稀释至100 μg/mL的没食子酸标准液。分别量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的没食子酸标准液，按1∶9比例加入Folin-Ciocalteus试剂［7］，再加乙醇使得终体积为2.5 mL。摇匀振荡3min后加入1%Na2CO3溶液1.5 mL，室温下避光静置1 h，于760 nm波长测定其吸光度，以没食子酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程：Y=21.786X+0.0003，r=0.9991。

2.2.2 金线莲中多酚提取量的计算［8］精密吸取样品溶液0.5 mL，按1∶9比例加入Folin-Ciocalteus试剂，摇匀振荡3 min后加入1.5 mL1%Na2CO3溶液，室温下避光静置1 h，以乙醇溶液为参比液，于760 nm波长测定其吸光度。按下式计算样品中多酚的提取量：

多酚提取量（mg/g）=C×D/m

式中，C为回归方程计算得到的没食子酸含量（mg/mL）；D为稀释倍数；m为称取金线莲样品的质量（g）。

2.3 单因素实验 根据文献报道和预实验结果，分别考察提取温度、超声时间、料液比和乙醇浓度等4个单因素对金线莲中多酚提取量的影响。

2.3.1 提取温度对多酚提取量的影响 称取干燥的金线莲样品，按1∶40料液比加入体积分数为30%的乙醇溶液，分别于提取温度20、30、40、50、60、70℃超声提取60min，测定提取液中多酚提取量。

2.3.2 超声时间对多酚提取量的影响 称取干燥的金线莲样品，按1∶40料液比加入体积分数为30%的乙醇溶液，分别超声提取20、40、60、80、100、120 min，设定提取温度为50℃，测定提取液中多酚提取量。

2.3.3 料液比对多酚提取量的影响 称取干燥的金线莲样品，分别以料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶45加入体积分数为30%的乙醇溶液，设定提取温度为50℃，超声提取60 min，测定其提取液中多酚提取量。

2.3.4 乙醇浓度对多酚提取量的影响 称取干燥的金线莲样品，按1∶40料液比加入体积分数分别为0%、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液，设定提取温度为50℃，超声提取60 min，测定其提取液中多酚提取量。

2.4 响应面试验设计 按照Box-Behnken试验设计原理，在单因素实验的基础上，选取提取温度（X1）、超声时间（X2）、料液比（X3）和乙醇浓度（X4）为因素，金线莲中没食子酸提取率为响应值（Y），设计四因素三水平的响应面试验。试验因素水平编码表见表1。

表1 因素水平表

2.5 验证实验 称取干燥的金线莲药材3份，按照最佳工艺条件进行提取，按照“2.1项金线莲中多酚的超声辅助提取工艺”，按“2.2多酚含量测定”项测定金线莲中多酚含量。

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 提取温度对多酚提取量的影响 见图1，结果显示，金线莲中多酚提取量随着提取温度升高有一定程度的增加，当提取温度为50℃时，其提取量最大；之后提取量逐渐下降。因此，选择提取温度设定为50℃。

图1 提取温度对金线莲中多酚提取量的影响

3.1.2 超声时间对多酚提取量的影响 见图2，结果显示超声时间较短时，金线莲中多酚提取量较小，可能时间较短不利于金线莲中多酚的提取。随着超声时间的增加，多酚提取量增加；当时间为60 min时，提取效果最好。

图2 超声时间对金线莲中多酚提取量的影响

3.1.3 料液比对多酚提取量的影响 见图3，结果显示低浓度的料液比可能使金线莲中多酚提取不充分，提取量较小；随着料液比的增加，多酚的提取量逐渐增加，当料液比为1∶40时，提取量最大。

图3 料液比对金线莲中多酚提取量的影响

3.1.4 乙醇浓度对多酚提取量的影响 见图4，结果显示不同体积分数的乙醇对多酚的提取有不同程度的影响；体积分数为30%的乙醇浓度对金线莲中多酚有较好的提取量。

图4 乙醇体积分数对金线莲中多酚提取量的影响

3.2 响应面实验结果 根据Box-Benhnken 的中心组合设计原理，采用Design Expert 8.0.6统计分析软件进行设计，实验设计方案与结果见表2。

表2 金线莲中多酚提取响应面试验设计及结果

（续表）

对上表中金线莲中多酚提取率（Y）及三个因素X1、X2、X3和X4的数值由Design Expert 8.0.6 软件进行二次回归模型拟合，回归分析结果分别见表3。

表3 金线莲中多酚（Y）模型的显著性检验及方差分析

对表3实验数据进行多元回归拟合，得到的二元多项回归方程为：

R=5.251-0.132 8A-0.062 4B+0.123 7C-0.055 8D-0.000 683AB-0.000 623AC+0.000 181AD+0.001 56B C+0.000 359BD-0.000 033 8CD+0.001 97A2+0.000 279B2-0.002 35C2+0.000 586D2

回归方程中个变量对响应值影响的显著性用F 检验来判定，概率P值小于0.05为有显著性差异，小于0.01为有极显著性差异。由表3分析结果看，整体模型的P＜0.05，表明该二次方程模型显著。而且方程的失拟项不显著（P＞0.05），说明非试验因素对试验结果的影响不大，可用于金线莲中多酚提取实验预测。因素B，D，BC，C2，D2为显著影响因素，影响大小顺序为：超声时间＞乙醇浓度＞提取温度＞料液比。两两因素之间的交互作用中，超声时间和料液比的交互作用对金线莲中多酚提取效果影响显著。金线莲中多酚提取的等高线图与响应面3D图谱见图5。

图5 提取时间与料液比对金线莲中多酚的响应面及等高线图

由结果可知，模型的校正决定系数RAdj2为0.991 0，表明此模型能解释99.10% 响应值的变化，即此模型与数据拟合度较高，实验误差影响较小。说明应用响应面法优化的金线莲中多酚提取工艺准确可靠。

3.3 最佳提取工艺 根据Expert 8.0.6软件分析结果，金线莲中多酚的最佳提取工艺为：提取温度42.51℃，超声超声时间72.14 min，料液比为1∶40.02，乙醇浓度为49.77%，此条件下金线莲中多酚提取率预测值为2.92 mg/g。

3.4 验证实验 为确保该工艺的稳定性与合理性，根据响应面法得出的最佳提取工艺条件进行验证（n=3），按照2.1项方法制备供试品溶液，测定金线莲中多酚含量。为方便实验具体操作，将提取温度设定为43℃，超声超声时间72min，料液比为1∶40，乙醇浓度为50%。实际测得金线莲中多酚平均提取量为2.89 mg/g，与理论预测值（2.92 mg/g）相比无显著性差异（P＞0.05）。因此，采用Box-Benhnken的中心组合试验设计优化的金线莲中多酚提取工艺条件稳定可行，准确可靠。

4 小结与讨论

（1）本研究采用响应面法［9］（Design-Expert软件）考察金线莲中多酚的提取工艺，并且根据二次方程模型分别做出了试验因素间交互作用的三维立体响应曲面和等高线图。结果显示，二次方程的模拟回归差异显著，失拟项不显著，表明实验建立的二次回归方程能较好地反映考察因素与响应值之间的关系，实验设计合理。

（2）本实验首先通过单因素试验分析不同因素对金线莲中多酚提取量的影响，确定了合适的提取条件；再根据 Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，以金线莲中多酚提取量为响应值，提取温度（X1）、超声时间（X2）、料液比（X3）和乙醇浓度（X4）为因素为影响因素设计的响应面分析实验。通过对响应值结果分析，获得金线莲中多酚最佳提取工艺为：提取温度43℃，超声超声时间72 min，料液比为1∶40，乙醇浓度为50%。通过验证实验，与模型预测值基本相符，证明了该工艺的可行性。

（3）超声辅助提取金线莲多酚工艺操作简单，提取时间较短；超声波能较好地击破中药材的细胞壁，有利于有效成分的溶出；提取过程化学试剂使用量较少，减少试剂的污染；即具有高效、省时、绿色环保等优点。该提取工艺可为金线莲多酚的进一步开发利用研究提供科学依据，具有良好的应用前景。