五种植物精油对鸭疫里默氏菌体外抑菌效果观察

左春生， 徐光科， 焦凤超， 李迎晓， 吴海港， 何 敏， 黄 立， 赵 聘

（信阳农林学院/河南省水禽资源开发利用与疫病防控工程技术研究中心，河南信阳464000）

鸭疫里默氏菌（RA）可感染鸭、鹅、火鸡等多种禽类，病原体可引起以浆膜炎为特征的败血性疾病，又称鸭传染性浆膜炎，可导致高死亡率和显著性经济损失（Jiakai Sundd 等，2019）。

随着各类抗生素和化学合成药物的普遍使用，越来越多的鸭疫里默氏菌耐药菌株产生，并且药物残留问题给畜牧业和人类健康带来了巨大的危害。2013—2018年分离的137株耐药菌中，共检测到162个耐药菌株的高频突变位点，分析结果显示，只在GyrA发生Ser83Ile突变的菌株MIC值增加了8～16倍，所有突变菌株均对氨苄西林、孢噻呋、喹诺酮 、氨基糖甙耐药 （Zhu等，2019；朱元军等，2019）。

植物精油是一种绿色、安全的植物源性药物，具有抗菌、增强免疫力、提高应激及改善生产性能的优点，是目前新型饲料添加剂研发的重点和热点之一。其作为抗生素的替代品运用到畜禽生产上具有很大的潜力。随着国内外学者的不断研究，植物精油的应用也在日益加深，其在医学方面、植物保护、食品行业以及日化产品中扮演着越来越重要的角色（刘涛等，2009；丁玉军等，2009；张万里等，2009；李有志等，2007；杜传来等，2004）。 本文以探讨五种植物精油对鸭疫里默氏菌的体外抑菌效果为研究目的，为防治鸭疫里默氏菌病天然药物开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药品 桉叶油，桉叶素≥70.0%；紫苏油相，紫苏醛≥25.0%；陈皮油，柠檬烯≥86.0%；薄荷油，总醇量（以薄荷醇计）≥79.0；肉桂油，肉桂荃≥71%（四川恒瑞通达提供）。

1.1.2 菌种与培养基 RA血清1型标准菌株由上海兽医研究所胡青海博士惠赠。质控菌株大肠杆菌ATCC25922购自中国兽医药品监察所。TSA琼脂培养基、TSB培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.3 试验仪器 Tu1810分光光度计、20334008电子天平，上海精密科学仪器有限公司；LHP-400恒温培养箱、LB-111B恒温培养摇床，常州润华电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的复苏与鉴定 将保存的菌株稀释后划线接种于TSA平板，置于烛缸中37℃培养36 h，挑取可疑菌落转接种TSA培养基（含5%胎牛血清）纯培养后，革兰氏染色和瑞氏染色后检查细菌形态。挑取TSA培养基纯化后的单菌落转接种TSB培养基（含5%胎牛血清）增菌培养后待用。

1.2.2 接种培养 挑取一接种环平板菌分别接入5 mL相应的液体肉汤培养基中，置恒温振荡器（转速为200 r/min）37℃振荡培养24 h后，以2%的接种量分别接种到100 mL 37℃预热的TSA中，摇匀后，分装于12支试管中置气浴恒温振荡器，37℃振荡培养，此一时间设为0。然后在不同时间间隔内（表1），任取一管液体培养物以无菌生理盐水连续作10倍稀释，采用平板表面涂布计数法，进行活菌计数。

按各试管号的时间取菌液，取稀释的后三个稀释度，准确吸取50 μL均匀涂布到灭菌后的固体培养基上，每个时间点做三个平行琼脂平板，在37℃恒温培养箱内培养18～24 h，然后计数（一般菌落数在30～300个为宜，50个左右最好）。

1.2.3 细菌计数 细菌计数按农业农村部颁发的兽医生物制品规程进行。即分别将TSB培养物进行 10、102、103、104、105倍稀释， 然后取 0.1 mL 的稀释液接种TSA平板，每个稀释度做两个平板，置蜡烛罐中，37℃培养24 h，进行菌落计数，两个平板上菌落的平均数即为该稀释度的细菌数，再按稀释度计算每毫升菌液的细菌含量。

1.2.4 生长曲线测定 以每毫升cfu log10对数值为纵坐标，生长时间为横坐标，分别绘制三种培养基增菌的生长曲线。

1.2.5 菌悬液的制备 用灭菌水将对数生长期菌落洗下制成菌悬液,再用生理盐水把制备好的菌悬液以10倍比稀释，使菌液的浓度为105～106cfu/mL。放在4℃冰箱保存或立即接种培养（蔡红等，2013；郎利敏，2011）。

1.2.6 精油药敏片的制备 每瓶放100个6 mm大小的滤纸片，分别加入300 μL桉叶油、紫苏油、陈皮油、薄荷叶油，对照组加入等量生理盐水，浸泡30 min。无菌条件下，分别将浸有不同植物精油的药敏片贴到涂布有菌悬液的TSA培养基平板上，培养24 h，每种精油设置2个平行试验。

1.2.7 最小抑菌浓度的测定 精油配制：取50 μL不同的植物精油用70%乙醇定容到5 mL，即将其稀释成1%（V/V）的精油原液。用蒸馏水将以上的精油原液采用倍比稀释法稀释到0.0625%备用。测定方法：以桉叶油为例，取装有2.5 mL TSB培养基的试管12个并依次标号，向1号试管加入2.5 mL上述配制的精油原液，充分吹吸均匀，再从第一管中吸取2.5 mL液体加到2号试管中，重复上述步骤，吹吸均匀后吸取2.5 mL于3号试管中，第10号试管的液体弃去；然后向1到10号试管里各加入100 μL的菌悬液，11号试管只加精油不加菌悬液，12号试管不加精油只加菌悬液，作为对照组。置于烛缸中37℃培养24 h，分光光度计600 mm可见光测量各管的浊度，测定精油对鸭疫里默氏菌的最小抑菌浓度（MIC）。

2 结果与分析

2.1 鸭疫里默氏菌生长情况 鸭疫里默氏菌培养计数试验数据分析如表1和图1所示。

2.2 每种植物精油对鸭疫里默氏菌的敏感性将贴过药敏片的培养基于烛缸中37℃培养24 h，观察抑菌圈的大小，然后再用游标卡尺测定每个抑菌圈的直径，重复三次，计算每种精油抑菌圈的平均值。抑菌圈直径小于10 mm为耐药；10～15 mm为低度敏感；16～20 mm为中度敏感；20 mm以上为高度敏感。试验结果见表2。

表2 精油敏感性判定

2.3 精油对鸭疫里默氏菌的最小抑菌浓度测定由表3可知，桉叶油、肉桂油、陈皮油、紫苏油、薄荷油分别在第 4、3、4、3、2 管 OD 值急速增大，MIC 分 别 为 78.12、156.24、78.12、156.24、312.5 μL/L。综合评定五种精油对鸭疫里默氏菌的抑菌效果分别是桉叶油＞肉桂油＞陈皮油＞紫苏油＞薄荷油。

3 讨论与结论

试验过程中由于精油原液颜色不同与肉汤混合后会有不同程度的浑浊；不同稀释度精油混合肉汤产生轻微乳浊样，对试验结果的观察造成困扰。采用紫外分光光度计测定每个管的浊度，取得各管培养前后OD的变化值可减小试验误差。

研究表明，肉桂醛对大肠杆菌、沙门氏菌 、黄色葡萄球菌、链球菌具有较强的抑菌效果 （袁瑶等，2019；王康莉等，2019）

陈林林（2010）发现，柑橘皮精油对大肠杆菌、白色葡萄球菌和青霉均有较强的抑菌作用，对大肠杆菌的抑菌作用最强；紫苏叶油化学成分的研究表明其主要成分为紫苏醛，还有少量的柠檬烯及少量α一蒎烯等。张子扬等（1990）对紫苏叶油进行的抑菌性试验结果表明，紫苏叶挥发油对金黄色葡萄球菌的MIC值为500 μg/mL；王红星等（1996）发现，桉叶油的主要成分没食子酸有明显的抑菌效果；周露等（2011）研究了薄荷精油对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、烟曲白色念珠菌的抗菌活性，结果显示薄荷精油对大肠杆菌、金霉菌、白色念珠菌有明显的抗菌活性。

关于精油对鸭疫里默氏菌体外抑菌试验，国内鲜见报道。另外精油提取原料选材、提取工艺、有效成分、抑菌机理或对鸭疫里默氏菌病的治疗效果尚需进一步深入研究。

表3 桉叶油对鸭疫里默氏菌的抑菌性测定数据