HT-2毒素对小鼠MII期卵母生殖细胞甲基化基因及DNA甲基化的影响

邓凯伟，童翠红

（信阳农林学院，河南信阳464000）

DNA甲基化为DNA化学修饰中的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。也就是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。甲基化基因Tet（Tet1、Tet2、Tet3）家族蛋白能将 5-甲基胞嘧啶（5-mC）氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），从而促进 DNA的主动去甲基化。Tet1在小鼠的胚胎干细胞中表达量很高，并已经被证明参与小鼠胚胎干细胞的维持（范安然，2013；Gu 等 2011）；Tet2 可以导致相关组蛋白修饰的改变以调控基因表达，与机体正常造血调控密切相关；Tet3在MII期卵母细胞表达量会显著上升且主要参与受精过程中父本基因组的重编程，当敲除雌性小鼠卵母细胞Tet3时，其生育能力下降。HT-2毒素影响基因的表观修饰进而引起生殖障碍等（Hsu等1972），会导致机体出现内分泌发生变化等症状（Wu等，2010）。研究表明，DNA甲基化状态在卵母细胞中尤为重要，它对卵母细胞中基因的调控和胚胎中特定基因的激活具有促进作用（Bird等，1985）。

本试验旨在阐明该毒素对小鼠MII期卵母细胞甲基化基因、DNA甲基化及卵巢质量的影响，对小鼠卵巢重量及HT-2毒素对小鼠MII期卵母细胞生殖毒性引起Tet1、Tet2、Tet3甲基化基因及DNA甲基化的变化进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂 HT-2毒素 （批号LPA0S118CAS：26934-87-2），二甲基亚砜（DM-SO）（批号 SHBJ7919），磷酸盐缓冲液（PBS）（批号 PB2004Y）， 透明质酸酶 （批号 19877177），TCM-199（批号 TBD11150），多聚甲醛，聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）（批号 P0930-50G），TritonX-100（批号T8200），均购自美国 Sigma公司；绒毛膜促性腺激素（HCG）（批号 180117），孕马血清促性腺激素（PMSG）（批号 S170714），均购自宁波市三生药业有限公司；RNA-Be-Locker A试剂（批号E613KA8733），购自上海Sangon生物技术公司；白蛋白（批号630G055），购自北京索莱宝科技有限公司；山羊抗兔568IgG，山羊抗小鼠488IgG，5-mC 抗 体 （ 批 号 21818005），5-hmC（10617005），均购自艾搏抗（上海）贸易有限公司；RNase-Free DNase Set试剂盒，购自 QIANEN公司；RNA提取液（批号G3013），购自武汉谷歌生物科技有限公司；未说明试剂均购于美国Sigma公司。

1.1.2 主要设备 电热鼓风干燥箱（型号CS101-1E），电热恒温培养箱（型号BTL-50A），均购自重庆万达仪器有限公司；洁净工作台（型号SW-CJ-1D），购自广州瑞智净化设备有限公司；体式显微镜，购自上海蔡康光学仪器有限公司；高速冷冻离心机 （型号 KDC-140HR）， 荧光显微镜（Nikon C1Plus），荧光定量 PCR 仪（Stepone plus），均购自塞维尔（谷歌）生物科技有限公司。

1.1.3 试剂的配制 孕马血清促性腺激素（PMSG）：将1000 IU的PMSG溶于超纯水中配成100 IU/mL的溶液，然后放于-20℃保存。

绒毛膜促性腺激素 （HCG）：将1000 IU的HCG溶于生理盐水中配成100 IU/mL的溶液，然后放于-20℃保存。

HT-2毒素：将HT-2毒素（10 mg）溶于22.75 mL的DMSO中，配成0.3 mg/mL的HT-2毒素浓储液。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物与管理 将体重为19～21 g，4～5周龄清洁级昆明雌性小鼠24只（信阳市卫生职业技术学院），随机分为4组，每组6只。自由饮水和采食，进行灌胃16 d。

1.2.2 小鼠的超排 灌胃第17天对小鼠腹腔注射10 IU的PMSG，48 h后对小鼠腹腔注射15 IU的HCG，16 h后采集试验动物MII期卵母细胞。

1.2.3 小鼠MII期卵母细胞的采集及处理 小鼠脱臼处死，取出卵巢进行称重记录。

将取出的输卵管置于37℃的PBS缓冲液中，在体式显微镜下，于输卵管壶腹部取出卵团，置于含0.03%透明质酸酶的M2培养液消化颗粒细胞，收集MII期卵母细胞。用37℃的PBS缓冲液清洗3次，最后将卵母细胞转移到离心管（100枚/管），每组3个重复，置于-80℃的干冰中冻存。

1.2.4 激光共聚焦 将MII期卵母细胞用37℃的PBS液体清洗3次，用4%的多聚甲醛在室温下固定15 min，再用0.1%的PVP清洗3次。用0.2%的TritonX-100在室温下停留30 min，再移入4 mol/L的盐酸中停留15 min。于37℃的PBS液体清洗3次，移入1%BSA放置4℃的冰箱封闭过夜。12 h后，小鼠单抗、兔单抗各加10 μL，37℃的恒温培养箱中固定2 h。用0.1%的PVP清洗3次，再加入二抗（山羊抗小鼠488、山羊抗兔568）各 10 μL，37 ℃的恒温培养箱中固定 1 h，再用37℃的PBS液体清洗3次，每次停留5 min。载玻片上每个液滴里放入2～4枚卵母细胞，加入荧光萃取剂，盖上盖玻片进行封片。

用Image-Pro Plus 6.0软件将绿色/红色荧光单色照片转换为黑白图片，然后选取相同的黑色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值（IOD）以及组织的像素面积（AREA）。并求出平均光密度值（AO值），AO=IOD/AREA，AO值越大表明阳性表达水平越高。

1.2.5 实时荧光定量分析

1.2.5.1 基因引物序列 根据GenBank上登录的小鼠Tet1、Tet2及Tet3基因序列，应用Oligo7.0和Primer6软件设计引物，引物由武汉塞维尔生物科技有限公司合成。引物相关信息见表1。

1.2.5.2 总RNA提取与反转录 采用QIAGEN试剂盒提取总RNA，按照试剂盒中的操作步骤说明进行小鼠卵母细胞总RNA提取。

取2 μg总RNA放置于PCR管中，加入1 μLOligo（dT），加去离子水直至 12 μL。 放于 PCR 仪上65℃保温10 min，快速置于冰上冷却。然后依次加入 4 μL 5× Reaction Buffer，2 μL 10 mmoL dNTP Mix，1 moL RiboLock RNAase抑制剂和 1 moL RevertAi M-MuLV逆转录酶，用移液枪充分混匀。放于PCR仪上42℃保温60 min，最后在70℃水浴中保温5 min。

表1 荧光定量PCR检测基因引物序列

1.2.5.3 荧光定量PCR扩增 取0.2 mL PCR管，配制反应体系如表2，每个反转录产物配制3管。PCR扩增过程如表3。

表2 配制反应体系所需反应物及体积

表3 PCR扩增过程

1.2.6 结果处理

ΔΔCT法：

A=CT（目的基因，待测样本）-CT（内标基因，待测样本）；

B=CT（目的基因，对照样本）-CT（内标基因，对照样本）；

K=A-B；

表达倍数=2-K。

1.3 统计分析 采用SPSS 21.0软件对试验数据进行统计分析，试验数据以“平均值±标准误差”表示，用t检验进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 HT-2毒素对小鼠卵巢重量的影响 由表4可知，2 mg/kg HT-2毒素组的卵巢重量较对照组极显著降低 （P ＜ 0.01）；2 mg/kg组较 1、1.5 mg/kg组显著降低（P＜0.05）；其他各组间差异不显著（P＞0.05）。说明HT-2毒素会极显著降低小鼠卵巢重量，浓度为2 mg/kg时为其发挥作用的较适浓度。

表4 HT-2毒素对小鼠卵巢重量的影响g

2.2 HT-2毒素对小鼠卵母细胞甲基化基因表达的影响 由表5可知，Tet1、Tet2基因表达水平试验组和对照组无显著差异 （P＞0.05）；2 mg/kg组Tet3基因表达水平较对照组极显著降低 （P＜0.01）；2 mg/kg组较 1 mg/kg和 1.5 mg/kg组显著降低（P ＜ 0.05）；其他各组差异不显著（P ＞ 0.05）。表明HT-2毒素对小鼠卵母细胞中Tet1和Tet2基因的表达无显著性影响（P＞0.05），而使Tet3基因表达水平极显著降低（P＜0.01）。

表5 HT-2毒素对小鼠卵母细胞甲基化基因表达的影响

2.3 HT-2毒素对小鼠卵母细胞甲基化的影响由表6可知，HT-2毒素处理后，5-mC和5-hmC的AO值总体均为上升的趋势。5-mC的AO值中，1.5、2 mg/kg组较对照组和1 mg/kg两组极显著提高（P＜0.01）；1.5 mg/kg组与 2 mg/kg组差异极显著（P＜0.01）；其他组别间无显著差异（P＞0.05）。 5-hmC 的 AO 值中，1.5、2 mg/kg组较对照组和1 mg/kg组极显著提高（P＜0.01）。各梯度中5-mC和5-hmC平均光密度值间差异均极显著（P＜0.01）。说明HT-2毒素会导致小鼠卵母细胞甲基化总体水平的上升。

表6 HT-2毒素对激光共聚焦平均光密度值（AO值）的影响

3 讨论

3.1 霉菌毒素对动物生殖性能的影响 霉菌毒素能使动物体的生殖性能发生障碍。利用已被呕吐毒素污染的饲料对猪进行饲喂，发现该毒素可以直接干扰减数分裂时的微管动力学以及猪卵母细胞的成熟，进而降低猪的生殖性能（Schoevers等，2010）。 吴彩霞等（2007）研究表明，HT-2 毒素也会降低猪及家禽的繁殖性能和改变机体器官的相对重量。有研究表明，HT-2毒素具有穿透血脑屏障的能力，可以通过胎盘到达胎儿 （Wang等2014），从而导致流产，死胎等。有研究报道羊和牛口服微量的HT-2毒素后，卵巢功能发生变化，卵巢颗粒细胞活力显著降低，激素的分泌受到影响（Huszenicza等，2000）。 本试验结果表明，试验组小鼠在梯度2 mg/kg毒素下，卵巢重量极大地降低（P＜0.01）。这表明该种毒素可能通过影响卵巢的质量及其功能进而降低动物机体的繁殖性能。

3.2 霉菌毒素对甲基化基因的影响 李晓红等（2018）研究表明，几种真菌毒素即使在作用机理不尽相同的情况下，都可以增加DNA甲基化水平。朱程程（2016）研究表明，混合毒素和HT-2毒素等都会影响DNA甲基化水平，且HT-2毒素会提高DNA甲基化水平。已有研究表明，DNA甲基化水平对小鼠卵母细胞的生殖作用具有重要的调节作用，且Tet基因家族中的Tet3基因表达水平的波动会影响雌性小鼠的生育能力。因此通过检测Tet3基因的表达水平及细胞DNA甲基化的情况，可以一定程度上从分子水平反映该毒素对小鼠MII期卵母细胞的生殖毒性。

RT-PCR结果表明，2 mg/kg HT-2毒素组小鼠卵母细胞相关调控DNA去甲基化的Tet家族基因中Tet3基因的表达极显著降低 （P＜0.01）；免疫荧光激光共聚焦结果表明，HT-2毒素会极显著提高小鼠卵母细胞DNA甲基化水平 （P＜0.01）。HT-2毒素对小鼠卵母细胞生殖毒性的影响及具体分子机制还需要进一步的研究。

4 结论

本试验结果表明，HT-2毒素均会使小鼠卵巢比重降低，这可能是该毒素降低动物体生殖性能的原因之一。另外，从RT-PCR和激光共聚焦荧光检测结果可知，HT-2毒素可通过影响Tet家族基因中Tet3基因表达水平进而影响小鼠卵母细胞DNA甲基化水平。