脑梗塞大鼠病理模型神经干细胞的变化及中药的影响

王阳 蓝海燕 王镇波 陈刚 吴旭庭 黄仲坚

【摘要】 目的 探讨脑梗塞大鼠病理模型神经干细胞的变化及中药的影响。方法 购置Wistar大鼠90只， 随机取20只作为空白对照组;70只建立脑梗塞大鼠病理模型， 建模成功后随机分为模型对照组（40只）和低、中、高剂量中药组（各10只）。空白对照组、模型对照组术后35、40、45、50、55、60 d分批处死大鼠， 免疫组织化学法检测5-溴脱氧尿苷（Brdu）+标记阳性细胞， 确定海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量。空白对照组、模型对照组均常规喂养， 低、中、高剂量中药组用补阳还五汤干预， 60 d后对各组效果进行评估比较。结果 模型对照组术后35、40、45、50、55、60 d海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量均高于空白对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）;模型对照组随着检测时间的延长神经干细胞数量呈下降趋势， 不同时间点比较差异有统计学意义（P<0.05）。高剂量中药组海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量分别为（38.47±3.10）、（19.32±1.59）、（7.14±1.43）、（7.97±1.31）、（4.02±1.01）， 中剂量中药组分别为（43.45±3.23）、（21.85±0.67）、（8.64±1.67）、（8.21±1.26）、（4.75±1.14）， 低剂量中药组分别为（38.43±3.16）、（19.36±0.61）、（7.13±0.89）、（7.95±1.13）、（4.00±0.99）， 模型对照组分别为（13.79±3.29）、（5.49±1.11）、（2.79±1.43）、（3.16±0.78）、（1.82±0.12）， 空白对照组分别为（7.71±2.31）、（3.25±0.59）、（2.42±0.42）、（1.12±0.23）、（0.92±0.11）;高、中、低劑量中药组海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量明显高于模型对照组和空白对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）;中剂量中药组海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量增加明显。结论 脑梗塞大鼠病理模型的建立能激活神经干细胞活性， 使神经干细胞增殖分化， 补阳还五汤能促进神经干细胞增殖分化， 使神经功能恢复， 以中剂量药物更利于神经再生。

【关键词】 补阳还五汤;脑梗塞病理模型;神经干细胞;电脉冲刺激

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.21.091

脑梗塞是由于脑部血液供应障碍、缺氧或缺血引起的局限性脑组织缺血性坏死或软化。临床上， 将脑梗塞分为脑血栓形成、腔隙性梗死和脑栓塞等， 占全部脑卒中的80%[1]。临床研究表明， 脑梗塞与糖尿病、高血压、心律失常等疾病有关， 临床多表现为猝然昏倒、半身不遂、言语障碍等， 影响患者的健康、生活。目前， 对于脑梗塞的治疗临床上采用中药及针灸方法一直是传统医学的优势与特点。补阳还五汤是中医代表性处方， 且该方的研究从药理作用、配方规律及物质基础均具有大量研究。但是， 国内外研究更多的集中在脑卒中的急性期脑缺血性损伤， 给药时间较短， 导致理论与临床存在一定差距[2]。近年来， 随着医疗技术的不断发展， 神经干细胞治疗神经系统疾病成为崭新的领域， 但是其具体机制尚未阐明。因此， 本研究以Wistar大鼠作为研究对象， 探讨脑梗塞大鼠病理模型神经干细胞的变化及中药的影响， 报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料来源 2018年8月～2019年5月购置于医科大学实验动物房Wistar大鼠90只， 雄性， 体重230～

280 g， 完成大鼠的常规喂养、光照。随机取20只作为空白对照组;70只建立脑梗塞大鼠病理模型， 建模成功后随机分为模型对照组（40只）和低、中、高剂量中药组（各10只）。

1. 2 仪器与设备 4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司）、苏木素-伊红（HE）染色（北京索莱宝科技有限公司）、PBS缓冲液（北京博奥森生物技术有限公司）、酶标仪（美国赛默飞世尔科公司）、组织切片机（德国Leica公司）、倒置显微镜（日本Olympus）等。

1. 3 方法

1. 3. 1 动物模型建立 对大鼠用10%水合氯醛完成腹腔麻醉， 用立体定位仪固定大鼠， 在右眼与右耳连线上做长为1.5 cm的切口， 钝性分离颞肌， 充分暴露颞骨。在倒置显微镜下予牙科钻在鳞状骨与颧骨交界处向嘴侧1 mm所对的鳞骨上钻直径为2 mm的小孔;用11号手术刀切开硬膜， 充分暴露大脑中动脉（MCA）并予电凝阻断， 颞肌复位， 缝合伤口， 模拟脑梗塞。术后24 h用“大鼠随机电脉冲刺激仪”（自制， 模拟劳则耗气、惊则气乱发病因素， 加重损伤刺激， 使大鼠肢体偏瘫症状延迟恢复， 未刺激手术大鼠由于其特殊脑血管分布， 侧支循环建立， 一般1周内偏瘫症状恢复）连续刺激15 d， 刺激方式：平均每30分钟刺激1次， 持续1 min/次， 频率0.5 Hz， 电压5～60 V逐渐调高。以行为变化（神经功能缺失）评分、外在表现、神经传导速度、肌电变化、经颅多谱勒（TCD）检查和脑组织病理学改变， 血及脑组织能量代谢， 微循环及血液流变学变化为主要模型判定指标[3]。

1. 3. 2 干预方法 空白对照组、模型对照组均常规喂养。低、中、高劑量中药组用补阳还五汤干预。补阳还五汤：生黄芪120 g、当归尾6 g、地龙3 g、赤芍4.5 g、红花3 g、川芎3 g、桃仁3 g， 经高温蒸馏水配制成补阳还五汤。低剂量组药物浓度5 g/kg， 中剂量组药物浓度7.5 g/kg， 高剂量组药物浓度10 g/kg， 灌胃2次/d， 60 d后对各组效果进行评估。

1. 4 观察指标

1. 4. 1 空白对照组与模型对照组神经干细胞变化 空白对照组（10只）、模型对照组各时间点（术后35、40、45、50、55、60 d）（5只）以断颈处死大鼠， 处死前均注射Brdu， 免疫组织化学法检测Brdu+标记阳性细胞， 确定标记海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量， 并对空白对照组与模型对照组神经干细胞变化进行比较。

1. 4. 2 高、中、低剂量中药组及模型对照组、空白对照组神经干细胞变化   取高、中、低剂量中药组大鼠10只， 以断颈方式处死， 完成神经干细胞数量的测定。对高、中、低剂量中药组及模型对照组、空白对照组神经干细胞变化进行比较。

1. 5 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 空白对照组与模型对照组神经干细胞变化比较

模型对照组术后35、40、45、50、55、60 d海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量均高于空白对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）;模型对照组随着检测时间的延长神经干细胞数量呈下降趋势， 不同时间点比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 高、中、低剂量中药组及模型对照组、空白对照组神经干细胞变化比较 高剂量中药组海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量分别为（38.47±3.10）、（19.32±1.59）、（7.14±1.43）、（7.97±1.31）、（4.02±1.01）， 中剂量中药组分别为（43.45±3.23）、（21.85±0.67）、（8.64±1.67）、（8.21±1.26）、（4.75±1.14）， 低剂量中药组分别为（38.43±3.16）、（19.36±0.61）、（7.13±0.89）、（7.95±1.13）、（4.00±0.99）， 模型对照组分别为（13.79±3.29）、（5.49±1.11）、（2.79±1.43）、（3.16±0.78）、（1.82±0.12）， 空白对照组分别为（7.71±2.31）、（3.25±0.59）、（2.42±0.42）、（1.12±0.23）、（0.92±0.11）;高、中、低剂量中药组海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量明显高于模型对照组和空白对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）;中剂量中药组海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量增加明显。见表2。

3 讨论

中枢神经系统内存在不断更新、分化潜能的神经干细胞已经成为共识， 但是脑梗塞对细胞数量及结构的影响研究较少。本研究中以大鼠作为对象， 建立脑梗塞大鼠病理模型， 分析其对神经细胞的影响。临床研究表明：Brdu能标记具有增殖活性的细胞， 而卵蛋白是神经前体细胞或神经细胞的特征性生物学标记。为了避免其他因素对脑内细胞的增殖， 本研究中给予Brdu+/Nsetin+双标阳性细胞确定增殖的神经细胞， 结果显示：模型对照组术后35、40、45、50、55、60 d海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量均高于空白对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）;模型对照组随着检测时间的延长神经干细胞数量呈下降趋势， 不同时间点比较差异有统计学意义（P<0.05）。说明脑梗塞大鼠病理模型的建立能激活神经干细胞活性， 可直接参与疾病的发生、发展， 可能与激活的神经细胞迁移、进一步分化有关。中医是脑梗塞常用的治疗干预方法， 能充分发挥中医辨证施治的效果。本研究中， 以补阳还五汤对大鼠进行干预， 方药由生黄芪、当归尾、地龙、赤芍、红花、川芎、桃仁组成。方药中生黄芪具有利尿消肿、补气、止汗功效;当归尾多用于经闭不通、瘀血积滞;地龙具有通络、平喘、利尿功效;赤芍具有清热凉血、活血祛瘀功效;红花具有活血通经、散瘀止痛功效;川芎具有活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛功效;桃仁具有活血祛瘀、止咳平喘功效;诸药共奏， 能发挥补气、活血、通络功效[4]。补阳还五汤用于脑梗塞大鼠中能减轻其脑部损伤， 利于大鼠恢复。本研究中， 高、中、低剂量中药组海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量明显高于模型对照组和空白对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）;中剂量中药组海马区BrdU+细胞、BrdU+/NeuN+细胞、BrdU+/PSA-NCAM+细胞、BrdU+/GFAP+细胞、BrdU+/CNPas+细胞数量增加明显。说明中剂量补阳还五汤干预更能提高神经干细胞活性。

综上所述， 脑梗塞大鼠病理模型的建立能激活神经干细胞活性， 使神经干细胞增殖分化;补阳还五汤能促进神经干细胞增殖分化， 使神经功能恢复， 以中剂量药物更利于神经再生。

参考文献

[1] 谭峰， 王健， 陈晶， 等. 电针对MCAO模型大鼠海马区内源性神经干细胞表达的影响. 中国中西医结合杂志， 2017， 37（2）：198-203.

[2] 李振， 程丹丹， 陈伟， 等. 褪黑素对脑缺血再灌注大鼠神经干细胞增殖的影响及机制研究. 中华神经科杂志， 2018， 51（12）：977-984.

[3] 平键， 陈红云， 周扬， 等. 骨髓间充质干细胞移植对四氯化碳大鼠肝损伤的影响及一贯煎的干预作用. 中国中药杂志， 2018（19）：3905-3912.

[4] 杨永祥， 叶玉勤， 苏鑫洪， 等. 创伤性脑损伤后大鼠海马区神经干细胞增殖及其与Janus激酶2/信号传导与转录激活因子3信号通路活性的关系. 中华创伤杂志， 2019， 35（5）：416-422.

[收稿日期：2020-03-23]