人参皂苷Rb1减轻人脐静脉内皮细胞氧化损伤

宋志明，余舒杰，焦 洁，李平平，李红梅，钱孝贤*

(1.河南大学第一附属医院 心内科， 河南 开封 475001； 2.中山大学附属第三医院 心内科，广东 广州 510630)

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心血管疾病发生和发展的病理基础。血管内皮细胞功能损伤是AS形成的重要机制之一，早于动脉粥样硬化形态学改变，在心血管病的预测和防治方面具有极其重要

的意义[1-2]。氧化应激会导致血管内皮细胞的功能紊乱，从而导致心血管疾病的发生[3]。细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion mole-cule-1, VCAM-1)参与AS的形成[4]，但其作用机制尚不清楚。人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，gRb1)已经被证实具有内皮细胞功能保护作用[5-6]。

本研究拟建立人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells ,HUVECs)氧化损伤模型，探讨gRb1的药理效果，为其进一步的临床应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

gRb1(HPLC 98.1%，成都普菲德生物技术有限公司)；H2O2、MTT、DMSO(Sigma-Aldrich公司)；异丙醇、无水乙醇(广州化学试剂厂)；Ⅰ型胶原酶、无血清培养基、M199培养基和胎牛血清(Gibco公司)；内皮细胞生长因子(BD公司)；细胞裂解液、蛋白定量试剂盒和凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；抗ICAM-1抗体(Cell Signaling Technology 公司)；抗VCAM-1抗体(Santa Cruz 公司)；抗GAPDH内参抗体(Proteintech Group公司)；小鼠及兔Ⅱ抗(武汉博士德生物工程有限公司)；分型SOD活性及MDA检测试剂盒(南京建成生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分离培养:原代HUVECs分离培养见既往报道[7]。若无特殊交代，研究所用细胞均为1～3代。本研究经河南大学第一附属医院伦理委员会批准，符合Helsinki原则。

1.2.2 细胞的分组与处理:H2O2氧化损伤诱导实验：细胞分为对照组和不同浓度的H2O2(20、40、80和160 μmol/L)组。gRb1氧化损伤保护实验：细胞分为对照组，H2O2(80 μmol/L)组和不同浓度的gRb1(10、20和40 μmol/L)组。细胞处理：取对数增殖的细胞按实验目的进行接种，培养24 h后加药刺激。按照不同实验目的，加药顺序为：gRb1作用0.5 h后加入H2O2培养24 h，收集细胞上清液、细胞和蛋白进行实验。

1.2.3 MTT法检测细胞存活率:细胞处理结束后，加入20 μL MTT(5 mg/mL)培养4 h；去除培养基后，每孔加入150 μL 的DMSO，用锡箔纸遮盖后置于摇床上15 min充分摇匀。最后在490 nm处，用酶标仪读取各孔的吸光度值(A490)，计算存活率。

存活率=实验组A490值/对照组A490值。

1.2.4 流式细胞检测细胞凋亡:操作过程见参考文献[5]。

1.2.5 SOD1活性及MDA含量的测定:用黄嘌呤氧化酶法测定细胞培养上清液中SOD1活性；用硫代巴比妥比色法(TBA法)测定MDA含量。操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 Western blot检测ICAM-1和VCAM-1蛋白:吸去培养基收集细胞，用1×磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2～3遍，加50～60 μL 细胞裂解液，低温孵育10 min，刮下细胞，将细胞裂解物吸至1.5 mL离心管中，4 ℃下以13 200 r/min离心15 min；吸取上清，分装保存以备后用。BCA蛋白定量后，取等量总蛋白进行SDS-PAGE 电泳后转移到NC膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入相应抗体，4 ℃摇床过夜孵育；弃去Ⅰ抗，1×TBST洗5 min×3次，加入小鼠或兔Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST洗3次后ECL显影，最后用Quantity One 软件扫描并分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 氧化损伤模型H2O2浓度的选择

与对照组相比，40、80和160 μmol/L H2O2显著抑制细胞存活率为64.2%±15.3%、53.3%±15.1%、25%±10.9%。将存活率转换为抑制率，测算得出IC50为78.62 μmol/L。因此，80 μmol/L H2O2为建立损伤模型的最佳浓度。

2.2 gRb1对细胞存活率的影响

与对照组相比，H2O2组细胞存活率明显受到抑制(P<0.05)。与H2O2组对比，20和40 μmol/L gRb1均能显著提高内皮细胞的存活率，且以20 μmol/L gRb1最为明显(P<0.05)(图1)。后续研究以20 μmol/L gRb1探讨其对细胞的保护作用。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H2O2 group图1 不同浓度gRb1处理对细胞活力的影响Fig 1 Effects of gRb1 with different dosages on cell

2.3 gRb1对细胞凋亡的影响

与对照组相比，H2O2组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。与H2O2组相比，gRb1组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)(图2)。

2.4 gRb1对细胞SOD1活性和MDA含量的影响

与对照组相比，H2O2组SOD1活性明显降低，MDA含量明显增加(P<0.05)。与H2O2组相比，gRb1组SOD1活性明显升高，MDA含量明显下降(P<0.05)(图3)。

2.5 gRb1对细胞ICAM-1和VCAM-1蛋白表达的影响

与对照组相比，H2O2组细胞ICAM-1和VCAM-1蛋白表达均明显升高(P<0.05)。与H2O2组相比，gRb1组ICAM-1及VCAM-1蛋白表达显著减少(P<0.05)(图4)。

3 讨论

动脉粥样斑块组织中存在大量凋亡的内皮细胞，这是细胞黏附分子产生以及单核、泡沫细胞黏附的主要机制。因此，内皮细胞功能损伤和凋亡已被公认为与心血管疾病的发生存在密切联系[8]。

内皮细胞损伤模型是阐明内皮损伤机制的重要工具，而H2O2诱导的内皮细胞损伤模型为目前广泛应用的研究内皮损伤的模型[9]。本研究通过细胞形态学和细胞存活率的检测，最终确定80 μmol/L H2O2为损伤模型的最佳浓度。

人参自古以来就被认为是一种增强机体抵抗力的中药。现代医学和药理研究表明, 人参皂苷为人参的主要有效成分， gRb1是含量最多的一种[10]。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H2O2 group图2 gRb1处理对H2O2损伤的HUVECs细胞凋亡的影响Fig 2 Effect of gRb1 on apoptosis of HUVECs injured by

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H2O2 group图3 gRb1处理对细胞SOD1和MDA的影响Fig 3 Effect of gRb1 on the SOD1 activity and MDA

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H2O2 group图4 gRb1对细胞内ICAM-1和VCAM-1蛋白表达的影响Fig 4 Effect of gRb1 on protein expression of ICAM-1 and

既往研究发现，gRb1能够改善自然衰老小鼠体内的氧化应激水平[11]。本研究显示，氧化损伤的内皮细胞中SOD活性减低，MDA含量增加。而gRb1能够增加SOD活性，同时减少MDA生成。

内皮细胞的异常凋亡是内皮损伤的生理反映，而ICAM-1和VCAM-1是内皮细胞损伤的主要标志[12]。本研究显示，在氧化损伤中，内皮细胞的凋亡异常增加，ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达也大幅增加。gRb1能够减少内皮细胞的凋亡，抑制细胞表面黏附分子的合成。

本研究结果显示，gRb1能够通过减少内皮细胞凋亡、氧化应激水平和黏附分子的合成发挥其改善H2O2诱导的内皮细胞损伤。后续的研究将进一步利用特异性抑制剂或基因沉默技术进一步阐释相关机制。