补肾活血中药对SD大鼠慢性高眼压模型初级视皮质磷酸化FoxO1和IKK2表达的影响

袁铭悦 李翔 刘红佶 刘欢 李祥玉

青光眼(glaucoma)是以特异性视神经(optic nerve，ON)损伤和视功能损害为特征的一类眼病，是全球仅次于白内障、可导致视力丧失的主要原因[1]。据统计，2013年，全世界40～80岁人群中，青光眼患病率为3.54%，有6 426万，预计到2020年和2040年分别将达7 602万和11 182万，约有60%青光眼患者分布在亚洲[2]。青光眼视功能损害的病因、病机复杂，迄今尚未明确。近年来，许多学者提出青光眼是一种中枢神经退行性病变[3]，病变涉及了包括视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)、视神经、视交叉、视束、外侧膝状体(lateral geniculate nucleus，LGN)、视放射、视皮质(visual cortex，VC)整个视路。因此，青光眼视功能保护研究应深入到视神经颅内段更广阔的范畴。

Qing G等[4]利用核磁共振检查原发性开角型青光眼患者发现中心视野未受损时相对应的VC区的神经元已出现了对视觉刺激的反应下降，表明青光眼患者视皮质神经元损伤可能早于目前常用视野计能检测到的视野改变，由此推断青光眼患者视皮质的改变可能不仅是RGCs及视神经的损伤的继发改变，还有可能是其主动参与了青光眼的发病。中医药对此的相关报道并不多。本实验采用烙闭上巩膜静脉的方法诱导产生眼压维持稳定、持续时间较长的慢性高眼压(elevated intraocular pressure，EIOP)模型，选用杞菊地黄丸合复方丹参片作为干预药物，通过SD大鼠眼压(intraocular pressure，EIOP)，初级视皮质(primary visual cortex，PVC)中尼氏小体、磷酸化FoxO1、IKK2的含量等客观指标观察补肾活血中药对大鼠慢性EIOP模型PVC损害的干预，探讨SD大鼠慢性EIOP模型视功能损害的中枢机制和补肾活血中药的干预及作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 清洁级SD大鼠30只，雌雄各半，8～12周龄，体重160～200g。饲养条件：空气流通，相对湿度55%～75%，室温20～25℃，12小时光照维持，昼夜循环，自由摄食饮水。纳入标准：①外眼无异常；②双眼瞳孔直间接对光反射无异常；③无歪颈。

1.1.2试剂 FoxO1(phospho-Ser319)抗体、IKK2抗体均由BeacomBio提供，批号分别为：BIO95906、BIO87319。

1.2 分组与给药方法

动物购回后，适应性喂养3天，进行IOP测量，正常IOP区间估计，取平均IOP在9～18mmHg者，以SPSS 20.0统计软件产生随机数字，分为3组，对照组，模型组和给药组进行单眼(右眼)造模。

对照组和模型组每天予3ml生理盐水灌胃；给药组以成人剂量的20倍换算，每天灌胃予0.96g/kg体重的复方丹参片、3.0g原生药/kg体重的杞菊地黄丸的混悬液3ml灌胃(混悬液制作：将复方丹参片、杞菊地黄丸磨成粉状，加入生理盐水)。每周称体重1次，根据大鼠体重变化调整给药量。每天同一时间段给药(16∶00-17∶00)。造模后1周开始给药，连续给药8周。

1.3 取材方法

大鼠灌胃8周后，大脑灌注固定法(参陈浩宇等[5]，结合本实验加以改良)： 3%戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉大鼠，大鼠仰卧暴露腹部，固定四肢，剑突下剪开胸腔，暴露心脏，将套有16号灌胃针针头的注射器经左心室插入升主动脉，同时剪开右心耳，快速推注含肝素钠注射液(20u/ml)生理盐水50 ml冲洗，以无血液流出为度，换4%多聚甲醛溶液50～80 ml灌注固定，先快后慢，约 10～15 min推完固定液，灌注结束后，开颅取出脑组织，固定液固定72h。

1.4 眼压测量

TNON-PEN XL眼压计每天同一时间段(14∶00-16∶00)测量IOP。术前3天连续测量大鼠IOP，取平均值为正常IOP；术后即刻、术后1w、术后2 w、术后4w、术后6w、术后8w，各测1次各组大鼠右眼IOP。

1.5 免疫组化检测PVC中磷酸化FoxO1、IKK2

脑组织固定72h后，参照《大鼠脑立体定位图谱(第三版)》[6]切取视皮质区脑组织，标本逐级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，做4μm连续切片，烘干备用。分别用BeacomBio的FoxO1(phospho-Ser319)及IKK2抗体染色，检测PVC磷酸化FoxO1、IKK2含量。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 补肾活血中药对SD大鼠慢性EIOP模型IOP的影响见表1

表1 各组大鼠组间及造模、用药前后IOP比较

2.2 补肾活血中药对SD大鼠慢性EIOP模型PVC中磷酸化FoxO1表达的影响见表2(图1)。

表2 补肾活血中药对SD大鼠EIOP模型PVC中磷酸化FoxO1表达的影响

表3 补肾活血中药对SD大鼠EIOP模型PVC中磷酸化IKK2表达的影响

图1 各组大鼠PVC中磷酸化FoxO1含量(免疫组化×400)Fig.1 p-FoxO1 in PVC of rats of all groups(Immunohistochemical method x400)

图2 各组大鼠PVC中IKK2含量(免疫组化×400)

3 讨论

青光眼视功能损害的病因、病机复杂，迄今尚未明确。目前认为，青光眼视功能损害可由多种因素共同作用引起的。目前认为，青光眼视功能损害可由多种因素引起，近年来，许多学者提出青光眼是一种中枢神经退行性病变[3]，青光眼患者视皮质的改变可能不仅是RGCs及视神经的损伤的继发改变，还有可能是其主动参与了青光眼的发病。

青光眼类似中医的“五风内障”及“青盲”，多由风、火、痰、郁、虚等导致气血失和，气滞血瘀，玄府闭塞，神水瘀积为病，病久肝肾两亏，神光衰微甚至泯灭、不睹三光而成“青盲”，所以肝肾虚损、脉络瘀滞是青光眼视神经病理改变的主要病机，滋养肝肾、活血化瘀为防治青光眼视神经损害的基本方法[7]。本实验选用杞菊地黄丸和复方丹参片作为研究药物，滋养肝肾、活血化瘀，杞菊地黄丸为经典古方，为滋补肝肾明目的代表方剂，复方丹参片活血化瘀，两者均为《中国药典》载入药品，非处方用药，经济实用，服用方便。我们前期研究也证实具有补肾活血中药(杞菊地黄丸和复方丹参片合用)对SD大鼠慢性EIOP模型视网膜、视神经、视中枢损伤及眼压控制后的青光眼患者视功能均有一定的保护作用[8-18]。

本实验病理组织学观察了PVC PI3K/Akt通路上磷酸化FoxO1和IKK2的表达。

近年来，关于PI3K/Akt信号通路(磷酸肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶，phosphatidylinostiol 3′-OH kinase/ protein kinase B，PI3K /Akt)调控细胞凋亡研究较多。Akt在PI3K调控下激活后，通过多种途径对细胞凋亡进行调控。包括①抑制NF-κB、FoxOs等转录因子的活性，调控凋亡；②磷酸化Bad、抑制caspase-9的磷酸化过程、抑制GSK-3活性，抑制凋亡；③抑制线粒体相关功能，抑制凋亡等[19]。FoxO1是FOX亚家族FoxO家族的一员，磷酸化后，会由细胞核转移到细胞质中，与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白结合，抑制细胞正常的周期、损伤修复及代谢活动，从而导致细胞周期停滞和凋亡[20-22]。IKK2为IKK的催化亚基[23]，是细胞因子介导的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化所必须的亚基结构[24]。NF-κB在生物体内各种类型的细胞中均存在，对细胞的凋亡具有双向调节作用。有研究证明IKK/NF-κB信号通路在中枢神经系统疾病中对起着重要作用，在神经细胞的凋亡过程中发挥着重要作用[25]。

本实验结果显示：采用的烙闭上巩膜静脉的方法建立的SD大鼠慢性EIOP模型可以使大鼠IOP升高，且可维持至少8周(实验结束时)。补精益视片可轻度降低SD大鼠慢性EIOP模型的眼压；阻断SD大鼠慢性EIOP模型初级视皮质中的尼氏小体的分解过程，改善初级视皮质的神经元的功能。 降低SD大鼠慢性EIOP模型初级视皮质中PI3K/Akt通路中p-FoxO1及IKK2的表达，可抑制SD慢性EIOP模型初级视皮质的神经细胞凋亡，对大鼠慢性EIOP模型的视功能具有作用。另外IKK2为NF-κB活化所必须的亚基结构，因此推测补精益视片可能可以降低SD大鼠慢性EIOP模型初级视皮质中NF-κB的表达。

综上，补精益视片可有效保护SD大鼠慢性EIOP模型的视功能，其作用表现在轻度降低IOP，提高PVC尼氏小体的含量，降低PVC中p-FoxO1及IKK2的表达。