HPLC法同时测定蒿茶中3种有机酸的含量

王 绒，杨 勇*，施晓琪，邹雯燕，付晨伟,纪香峰，喻春皓*，崔 超，孔 晶

(1.淮阴工学院 化学工程学院制药工程系，江苏 淮安 223003；2.江苏省特色资源开发与药用研究重点实验室，江苏 淮安 223003)

蒿茶又名芦蒿、藜蒿，是以菊科蒿属(CompositaeArtemisia)蒌蒿(ArtemisiaselengensisTurcz. ex Bess.)的纯野生香蒌尖为原料，采用现代制茶工艺加工而成的茶品，是集食用与药用于一身的养身保健佳品，每年清明节前后采摘加工而成的品质尤佳。蒌蒿性平、味甘，全草入药，有消炎、止血、化痰、镇咳等功效[1]。已有研究发现，蒌蒿中的化学成分主要包括黄酮、酚酸、萜类、香豆素、维生素和生物碱等[2-8]，其中黄酮和酚酸类成分被认为是其重要的活性成分[2,9-10]。有机酸类成分是中药中常见的一类组成物质，具有抗炎、活血化瘀等多种药理活性[11-16]。目前，关于蒿茶中有机酸的研究鲜有报道[10]。由于蒿茶作为一种茶叶饮品，冲泡后，其中有机酸类成分必然为人们饮用。因此，有必要测定其含量进行蒿茶的质量评价。本文对蒿茶的水提液进行了研究，发现了多种有机酸成分。在此基础上，本文以蒿茶中的有机酸类成分为指标，考察了蒿茶的提取方法，建立HPLC含量测定方法，并基于不同产地的蒿茶样品进行研究，旨在为进一步提高蒿茶的质量评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪、G1315B型DAD检测器(美国Agilent公司)；FA2004型电子天平(上海电子科技有限公司)；H1850R型医用离心机(长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司)；超声清洗仪(天津市瑞普电子仪器公司)；Smart-S15UV型实验室纯水系统(上海和泰仪器有限公司)。

新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品(中药对照品实验耗材中心，批号分别为01330-0226、01330-1008、01330-0418)；蒿茶样品分别购于茶叶店铺，共5个产地，江苏(批号：190528)、山西(批号：190101)、安徽(批号：190301)、甘肃(批号：181201)、陕西(180801003)。甲醇、乙腈和甲酸均是色谱纯；其他试剂均是分析纯；水是超纯水。

1.2 方法

1.2.1提取工艺优化

蒿茶作为茶叶饮品，冲泡后为人饮用，因此采用恒温浸泡提取工艺。通过L9(43)正交试验考察料液比、提取时间、提取温度、提取次数对总有机酸成分提取的影响，参数设置见表1。

表1 蒿茶提取工艺因素水平表

1.2.2溶液制备

(1) 对照品储备溶液的制备

精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品适量，加入甲醇溶解，配置成浓度均是0.8 mg·mL-1的对照品储备液。需要使用时精密吸取各个对照品储备液适量混匀，再经过稀释成混合对照品溶液即可(新绿原酸16 μg·mL-1、绿原酸48 μg·mL-1、隐绿原酸16 μg·mL-1)。

(2) 供试品溶液制备

以江苏蒿茶为例，按照下述步骤，制备5种不同产地蒿茶的供试品溶液。取江苏蒿茶(批号：190528)约1.0 g，按照正交试验最佳工艺条件，加30 mL超纯水，于水浴锅80℃恒温浸泡50 min，共提取3次，合并3次的提取液，离心，过滤，至100 mL的容量瓶中，定容，摇匀，经0.45 μm的滤膜过滤，即得到供试品溶液。

1.2.3色谱条件优化

本试验在最优提取条件下，采用Kromasil 100-5C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；柱温：30℃；检测波长320 nm；考察不同流动相体系：甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水对蒿茶HPLC方法分离效果的影响。

2 结果与分析

2.1 蒿茶提取工艺

由表2结果可知，浸泡提取主次影响因素为：料液比>提取次数>提取时间>提取温度，最佳提取条件为料液比1︰30 g·mL-1，提取时间为50 min，温度为80℃，提取次数为3次。

表2 蒿茶提取工艺正交设计表

2.2 HPLC色谱条件优化

甲醇和乙腈为流动相常用溶剂。本研究考察了不同流动相体系：甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水(见图1)，分别在320 nm检测波长进行HPLC分析，发现流动相为乙腈-0.1%甲酸时，分离时间与分离效果均优于其他三种流动相体系，因此，选择乙腈-0.1%甲酸水为流动相。

图1 不同流动相下HPLC谱图

2.3 方法学考察

2.3.1系统适应性试验

在“2.2”色谱条件下进行HPLC分析，混合对照品、江苏蒿茶供试品溶液与阴性对照的色谱图如图1所示，各组分分离度均大于1.5。

注：1: 新绿原酸；2: 绿原酸；3: 隐绿原酸

图2 对照品混标和供试品溶液的HPLC色谱图

2.3.2线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液1, 2, 4, 8, 16和20 μL，每个体积分别重复进样3次，注入液相色谱仪， 按照“2.1”色谱条件下分析，记录色谱图，以进样量(μg)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归，结果见表3。新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸这3种有机酸的峰面积在一定质量范围内线性关系良好。

表3 3种有机酸的线性关系

2.3.3检测限与定量限

精密量取“2.3.1”下对照品储备溶液适量，逐级稀释后按“2.1”色谱条件下分析，测得新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的检测限分别为1.1, 2.4, 3.4 ng，定量限分别为3.7, 7.8, 11.4 ng。

2.3.4精密度试验

按“2.3.1”项制备混合对照品溶液，在“2.1”色谱条件下，重复测定6次，结果显示新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸峰面积的RSD值分别为3.34%、3.00%、3.47%，说明仪器精密度良好。

2.3.5稳定性试验

取“2.3.2”项下制备的供试品溶液，在“2.1”色谱条件下，分别在0, 2, 4, 8, 16, 24 h内进行测定，结果显示，新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸峰面积的RSD值分别为1.10%、0.40%、1.48%，表明供试品在24 h内稳定。

2.3.6重复性试验

取“2.3.2”项下制备的供试品溶液6份，在“2.1”色谱条件下进行测定，结果显示，新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸峰面积的RSD值分别为2.05%、0.47%、3.35%，表明该方法的重复性良好。

2.3.7加样回收率试验

精密称取0.1 g已知含量的蒿茶9份，再分别精密加入新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品溶液适量，按“2.3.2”项下制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下，进行HPLC分析，计算平均加样回收率介于96.9%～104.6%，RSD介于2.0%～2.4%，表明该方法准确可靠(见表2)。

表4 加样回收率试验测定结果

2.3.8样品含量测定

精密称取5批蒿茶样品，按“2.3.2”项下供试品溶液制备方法制备，在“2.1”色谱条件下进行测定，计算各成分含量(见表5)。

表5 不同产地蒿茶中有机酸的含量测定结果 (mg·g-1)

由表5可知，不同产地的蒿茶中有机酸含量有所差异，江苏>陕西>安徽>山西>甘肃，其中江苏产地蒿茶中有机酸含量最高达到70.406 mg·g-1，甘肃产地蒿茶含量最低为2.849 mg·g-1，两者相差约25倍。

3 结论

本研究建立了HPLC法测定蒿茶中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸3种有机酸的含量，方法操作简便，具有良好的精密度、稳定性、重复性。将之用于考察提取工艺对有机酸含量的影响，并研究不同产地的蒿茶样品中有机酸的含量差异。研究结果发现，不同产地的蒿茶样本中，均检测到3种有机酸，有机酸含量范围为2.849～70.406 mg·g-1，含量最高相差约25倍。茶叶中的酚酸类成分具有抗氧化、降血脂等作用，本研究结果为蒿茶作为保健产品的开发及蒿茶的质量评价提供了一定的科学依据。