新疆2 家牛场引进安格斯牛的牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎和布鲁氏菌病检测

2020-08-07李欣宇马晓菁谢彩云易新萍赵红琼刘丽娅谷文喜

中国动物检疫 2020年8期

李欣宇，叶锋，钟旗，马晓菁，谢彩云，易新萍，赵红琼，姚刚，刘丽娅，谷文喜

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000）

安格斯牛原产于英国的阿伯丁、安格斯和金卡丁等郡，全称为阿伯丁-安格斯牛[1]，因性成熟早、屠宰率高、肉品优良、饲料转化率高、犊牛成活率高、难产率低，成为育种的父本或母本。1980年以来，我国越来越多的省份通过大量引进安格斯牛来改良当地品种。新疆自1999 年开始逐渐引进安格斯牛[2]。

牛病毒性腹泻/黏膜病（bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的，主要发生于牛的一种急性、热性传染病[3]；牛传染性鼻气管炎（bovine infectious rhinotracheitis，IBR）又称坏死性鼻炎（necrotic rhinitis）、红鼻病（red nose disease），是由牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的一种牛接触性传染病[4]。布鲁氏菌病（brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的人兽共患传染病[5]。BVD、IBR 和布鲁氏菌病均可引起母畜流产，产畸形胎或免疫力低下犊牛等，临床上很难治愈，可终身带毒，引起患牛生产性能下降或死亡，对养牛业造成严重经济损失。为了解新疆当地流行疫病对引进安格斯牛的影响，本研究选择新引进安格斯牛的育种场A 和原有安格斯牛的育种场B，开展了BVD、IBR 和布鲁氏菌病的血清学和病原学检测，以期为安格斯牛养殖场的疫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

A 场存栏安格斯牛2 922 头，全部为8月龄左右的母牛，2018 年9月初从澳大利亚引入。该批安格斯牛引进时，BVD、IBR 和布鲁氏菌病检测均为阴性，在隔离期间，全部进行了IBRV 疫苗免疫，入场4 个月后，全群补免了BVDV 疫苗，同时加强免疫了IBRV 疫苗，未免疫布鲁氏菌疫苗。A 场自安格斯牛引入后，再未引进新牛及购买冻精。B场总存栏安格斯牛370 头，其中育成母牛216 头、犊牛154 头，为当地引进安格斯牛2 年以上牛场，常年购买冻精进行母畜繁殖，未免疫BVDV、IBRV 和布鲁氏菌疫苗。

按照《动物防疫抽样规范》（DB11/T 677—2009）要求，按存栏量的5%随机抽样，尾静脉采血，共采集170 份血样，4 ℃保存，其中A 场150 份、B 场20 份。

1.2 主要仪器

微量移液器（型号TopPette），购自北京大龙兴创实验仪器有限公司；灭菌移液器枪头（型号BT224-YS），购自生工生物工程（上海）股份有限公司；恒温箱二氧化碳培养箱（型号BCJ80-S），购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PCR 扩增仪（型号AG22331Hamburg），购自德国Eppendorf 公司。其他仪器：计时器、洁净玻璃板、试管架等。

1.3 主要试剂

BVDV 抗原检测试剂盒、IBRV gB 抗体检测试剂盒，购自IDEXX 公司；EasyPure Blood Genomic DNA Kit、ddH2O，购自北京全氏金生物技术有限公司；2×PCRTaqPlus MasterMix with dye，购自爱必梦生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清稀释液（0.5%石碳酸、0.85%NaCl），自行配制；布鲁氏菌虎红凝集抗原、布鲁氏菌试管凝集抗原，购自中国兽医药品监察所；布鲁氏菌标准阳性血清、标准阴性血清，购自黑龙江省生物制品一厂。

1.4 检测方法

对采集的全血分离血清，用BVDV 抗原ELISA 检测试剂盒和IBRV gB 抗体ELISA 检测试剂盒，分别进行BVDV 抗原与IBRV 抗体检测。对IBRV 抗体检测阳性的全部样品，提取DNA，用特异性引物扩增。用虎红平板凝集试验（RBT）结合试管凝集试验（SAT）进行布鲁氏菌检测。

1.4.1 IBRV 抗体ELISA 检测按照IBRV gB 抗体ELISA 检测试剂盒说明书操作。

1.4.2 IBRV 核酸PCR 检测将4 ℃抗凝血管中保存的样品放置室温，按照病毒液DNA 提取试剂盒说明书提取DNA。参考文献[6]合成gI 引物：上游引物为5'-cggcggtcgagcggcaagag-3'，下游引物为5'-aggcgggaacacagctgggacaat-3'，预期扩增片段大小为398 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系为：PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，用ddH2O 补至25 μL。经反复试验摸索，确定PCR 扩增条件为：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.4.3 BVDV 抗原ELISA 检测按照BVDV 抗原ELISA 检测试剂盒说明书操作。

1.4.4 布鲁氏菌抗体检测采用RBT、SAT 方法，严格按照国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646—2018）操作。

2 结果

2.1 IBRV 抗体ELISA 检测

A、B 场的170 份样品全为IBRV 抗体阳性，抗体阳性率均为100%。

2.2 IBRV 核酸PCR 检测

经PCR 检测，A 场未检出IBRV 核酸阳性，阳性率为0；B 场检出4 份阳性，阳性率为20%（4/20）。阳性样品的PCR 检测结果见图1。

2.3 BVDV 抗原ELISA 检测

A、B 场全部170 份样品中，未检出BVDV抗原阳性，抗原阳性率均为0。

图1 B 场IBRV 阳性样品PCR 检测结果

2.4 布鲁氏菌抗体检测

A 场样品布鲁氏菌RBT 与SAT 法均未检出阳性，抗体阳性率均为0；B 场RBT 法未检出阳性，SAT 法检出1 份阳性，抗体阳性率为5%。

3 分析与讨论

本研究对新疆养殖安格斯牛的A、B 两个牛场进行BVDV、IBRV 和布鲁氏菌抗体和抗原检测，结果在A 场未检测出BVDV 抗原和布鲁氏菌抗体，IBRV核酸检测全为阴性，IBRV抗体检测全为阳性，说明该场新引进的安格斯牛未感染BVDV、IBRV和布鲁氏菌，IBRV 疫苗免疫效果良好；B 场已引进安格斯牛2 年以上，一直未进行过BVDV、IBRV 和布鲁氏菌疫苗免疫，但其IBRV 抗体阳性率为100%，IBRV 核酸PCR 阳性率为20%，布鲁氏菌抗体阳性率为5%，说明该场存在IBRV 和布鲁氏菌感染。

本次检测在2 个牛场虽均未检测到BVDV，所以存在较高的BVDV 感染风险，但因新疆地区的BVD、IBR 和布鲁氏菌病流行状况较为严重。2007 年郭燕[7]对新疆北疆部分集约化奶牛场进行BVDV 分子流行病学调查，发现平均抗原阳性率为35.4%；2019 年马振国[8]对新疆地区5 833 份牛血清进行BVDV 抗体检测，发现阳性率为52.03%。2012 年邹世颖等[9]对我国北方六省市进行IBR流行病学分析发现，新疆地区4 个规模化牛场的IBRV 抗体阳性率高达68%；2018 年张迎春等[10]对新疆南疆部分规模牛场进行IBR 血清流行病学调查，发现规模化奶牛场的IBRV 群抗体阳性率高达100%。2012 年李玲等[11]对南北疆、十三地州13 个县（市）的3 600 份牛血清进行布鲁氏菌抗体检测，发现阳性率为0.38%；2019 年齐姗姗[12]对新疆乌鲁木齐县的1 203 份奶牛血清进行布鲁氏菌抗体检测，发现阳性率为4.7%。

新引进的安格斯牛经进境检疫检测，虽可以保证未感染BVDV、IBRV 和布鲁氏菌，但引入后，因周边存在这些疫病的流行，防控稍有松懈，就会引入病原。因此，建议牛场实施全群IBRV 和BVDV 疫苗免疫，筛选并淘汰持续感染（PI）牛；严格外购冻精、胚胎的BVDV、IBRV 和布鲁菌检测；坚持自繁自养，慎重从场外引进牛只。