肺痹汤2号对二氧化硫染毒小鼠肺损伤的干预研究

刘艳芳 牛洁 吴志松 刘浩歌 焦扬

随着全球工业化进程的推进，大气污染日益严重。二氧化硫(SO2)是大气中最常见的污染物之一，研究表明[1-2]，大气SO2污染可增加呼吸系统发病率和死亡率。近年来国内外学者对SO2的毒理作用进行了实验研究，通过建立吸入SO2染毒的动物模型发现，SO2进入呼吸系统后可以造成肺组织损伤，引发肺组织炎症反应[3]。应用中医药可以干预炎性损伤过程，中医药对SO2损伤是否有预防或治疗的作用，目前这方面的研究寥寥无几。本课题组以中医学理论对SO2等细颗粒物污染加以分析，认为它不同于传统中医理论的六淫邪气、疫疠之邪，是一种新型的外来毒邪，存在于无法控制的环境空气中，与呼吸之气同在，活的生物体不可避免要吸入，因而危害范围广，预防、治疗难度大。对机体的损害具有不确定性，潜伏期长[4]。本实验通过观察肺痹汤2号对SO2染毒小鼠肺损伤炎症因子的干预作用，探索了中药影响SO2染毒小鼠肺损伤的部分机制，从而为SO2污染的防治提供理论基础，为研发防治SO2肺损伤的纯中药制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.1.1 实验动物及分组 雄性ICR小鼠48只，体重(20±2)g。小鼠购买于维通利华实验动物发展有限公司(实验动物合格证号：11400700059072)，寄养于中国中医科学院中药研究所动物房，自由进食和饮水，观察检疫、适应性喂养3天后，称重，随机分为4组，即空白对照组、模型组、中药预防组、中药治疗组，每组12只。

1.1.2 实验主要仪器 小鼠染毒箱 (PSU材质，规格330 mm×215 mm×200 mm，北京丹瑞林科技发展有限公司)，全自动多功能酶标仪(Multiskan MK3，Thermo，USA)，电热恒温培养箱(DH4000A，天津泰斯特)，恒温振荡摇床(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)，高速冷冻离心机(Hettich德国)，紫外分光光度计(上海尤尼柯公司UV-2000)，荧光定量PCR仪(ABI7500)，电泳仪、电泳槽(北京六一仪器厂试管)，凝胶成像仪(Tanon-6600 天能公司)，分光光度计(UV-2000，上海尤尼柯公司)，微量移液器等。

1.1.3 主要药品及试剂 肺痹汤2号方颗粒：由生黄芪、红景天、金银花、黄芩、丹参、生甘草组成，剂量比例为1.5∶1.5∶1.5∶1∶1∶1。使用北京康仁堂药业有限公司提供的中药配方颗粒进行本研究。染毒气体：高压液化SO2，纯度99.99%，由北京海普科技有限公司提供。10%甲醛、苏木素精、一氧化汞、硫酸铝钾、无水乙醇、蒸馏水、5%冰乙酸、伊红、95%乙醇、蒸馏水、盐酸、酒精、中性树胶、二甲苯。白介素-6 (interleukin-6，IL-6)测定试剂盒、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Green PCR Mixture、Dnase 1均由康为世纪生物科技有限公司提供。

1.2 造模、给药及取材方法

1.2.1 染毒时间 对模型组、中药治疗组、中药预防组的小鼠进行SO2静式吸入染毒处理。吸入时间：每日上午8点～12点，连续吸入4小时，连续21天，空白对照组同时吸入过滤后的新鲜空气。SO2吸入染毒时小鼠禁食禁水，其余时间小鼠自由进食饮水。

1.2.2 染毒方法 本实验中采取静式染毒的方式，SO2浓度：(28±2)mg/m3。将小鼠分组置于小鼠染毒箱(330×215×200 mm)中，染毒箱除进气孔外其他部位均为密封状态。根据染毒箱大小计算出所需99.99%SO2的体积，通过针管抽取相应体积的99.99%，经进气孔打入染毒箱后，迅速密封住进气孔，待SO2在染毒箱中扩散一段时间后再开启进气孔。通过泵吸式SO2检测仪监测染毒箱中SO2浓度，使SO2浓度保持在(28±2)mg/m3范围内。熏气染毒结束后，在出气孔处连接一负压吸引器，负压吸引器的另一头通向饱和碳酸氢钠溶液，以回收SO2气体，以免造成实验室空气污染。

1.2.3 给药方法 按照人与小鼠体表面积进行换算，给药剂量是成人临床剂量的等效剂量。中药治疗组自染毒处理后一周，既第8天起开始予肺痹汤2号方溶液10 mL/kg·bw灌胃，至第21天止，共灌胃14天，以模拟中药治疗SO2污染损伤；中药预防组自染毒处理前一周起，予肺痹汤2号方溶液10 mL/kg·bw灌胃，至染毒处理后第21天止，共灌胃28天，以模拟应用中药预防SO2肺损伤。空白对照组及模型组从染毒处理前一周到染毒处理后第21天，予0.9%生理盐水10 mL/kg·bw灌胃，共灌胃28天。

1.2.4 动物处死及取材 染毒处理后第21天结束之后，动物禁食、自由饮水20个小时，于次日早上8点，称重后以脱颈椎法处死小鼠。立即打开小鼠胸腔，肉眼观察双肺的形态、质地、颜色及有无明显的肺纤维化结节等改变。以5 mL冰冷生理盐水从右心室处注入，通过肺循环灌洗肺脏，反复几次，至双肺呈白色，立即将肺脏采出，称重。取小鼠左侧肺脏，在10倍于组织重的冰冷生理盐水中用不锈钢剪将肺组织剪碎，用玻璃匀浆器在0～4℃下研磨制成匀浆液。匀浆液用Hettich高速冷冻离心机在4℃下12000 rpm离心5分钟，取上清液即得到肺组织的粗酶提取液，按相应试剂盒说明书用酶联免疫吸附剂测定法进行IL -6、TGF-β1检测。四组小鼠中每组选取6只小鼠用Real time-PCR方法检测小鼠肺脏组织中IL -6 mRNA、TGF-β1 mRNA、乳腺复原蛋白-39(breast recovery protein-39，BRP-39) mRNA转录水平的变化情况。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 中药肺痹汤2号方颗粒对染毒小鼠肺组织IL-6的影响

与空白对照组相比，吸入SO2的模型组小鼠肺组织内IL-6、IL -6 mRNA含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，中药治疗组及中药预防组小鼠肺组织内IL-6、IL -6 mRNA含量均有下降趋势，但统计学上未见显著意义。见表1。

表1 各组小鼠肺组织IL-6及IL-6 mRNA含量比较

2.2 中药肺痹汤2号方颗粒对染毒小鼠肺组织TGF-β1的影响

与空白对照组相比，吸入SO2的模型组小鼠肺组织内TGF-β1、TGF-β1 mRNA含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，中药预防组小鼠肺组织TGF-β1 mRNA含量显著下降(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肺组织TGF-β1及TGF-β1 mRNA含量比较

2.3 中药肺痹汤2号方颗粒对染毒小鼠肺组织BRP-39 mRNA的影响

与空白对照组相比，吸入SO2的模型组小鼠肺组织内BRP-39 mRNA含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，中药预防组小鼠肺组织BRP-39 mRNA含量显著下降(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠肺组织BRP-39 mRNA含量

3 讨论

SO2对组织的致炎作用是其毒理作用重要机制[5]。应用中医药是否可以干预炎性损伤过程，目前这方面的研究很少。通过实验研究证明，在中医理论的指导下，中药经过配伍形成的方剂肺痹汤 2 号可以促进 SO2染毒小鼠肺组织炎性渗出的吸收。

SO2污染存在于无法控制的环境空气中，是一种外来毒邪。SO2损伤人体先经鼻咽，入肺后直接消耗肺气，损伤正气，影响肺之宣发、肃降；对于宿有肺疾之人，其气本虚，SO2可致肺气更虚，导致疾病症状加重或诱发宿疾，使气血津液运行失常，产生气滞、痰凝、血瘀等病理变化。针对以上对于病因病机的分析，应以扶正祛邪为基本治疗原则，故立治法为：补气解毒，化痰通络，制定肺痹汤2号方。

肺痹汤2号方是由全国名老中医周平安教授的经验方肺痹汤化裁而来。周平安教授用此方治疗肺纤维化之肺气亏虚，痰瘀阻络证，临床收效甚宏[6-7]。周平安教授认为肺间质纤维化的病机以肺气虚损为内因，外邪乘肺虚而内舍于肺，肺气虚无力鼓动血脉则血运迟缓，又有邪气闭阻肺络，气血失和，气血失于流畅，日久血液瘀滞，与痰浊搏结，痰瘀痹阻肺络而发。病机与SO2肺损伤相近，肺气虚损，邪气伤肺，瘀血、痰浊等继发的病理产物互相搏结，留于肺络，治疗需补益肺气，化痰通络。不同之处在于治疗SO2肺损伤除补肺气，化痰通络外，还需解毒祛邪，故将肺痹汤化裁，减少其化痰通络之药味，增强解毒祛邪之力，故定名为肺痹汤2号。方中黄芪补益肺脾之气，益卫固表，升阳举陷，利水消肿，托毒生肌; 红景天补益肺气、健脾补虚、收涩止血、活血散瘀，与黄芪相配合补益肺气，扶助正气，二者共为君药。金银花清热解毒，散痈消肿，疏散风热，黄芩清热燥湿，泻火解毒，与金银花配合增强解毒祛邪之力，二者为臣药。丹参活血通经，凉血消肿，在本方中为佐药，针对肺气受损、血行迟滞的病机变化。甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、调和诸药的作用，既可助黄芪补益肺气，又能祛痰止咳解毒，还可调和诸药，为佐使药。全方共奏补益肺气、解毒、化痰、活血之功。

近年来许多研究证明，SO2进入呼吸系统后可以造成肺组织损伤，SO2及其衍生物可激活血液淋巴细胞和肺泡巨噬细胞，产生大量致炎细胞因子[8]，IL-6、TGF-β1、BRP-39在炎症的发生、发展中起重要作用，在小鼠的肺部炎症和损伤中起着关键的作用。IL-6的基因表达失常是解释许多疾病的基础，IL-6主要产生于激活的巨噬细胞，可促进炎症介质释放，它既能调节T细胞、B细胞和单核-巨噬细胞的免疫活性，又参与某些免疫病理的发生[9]。TGF-β1是一种抗炎因子，可以抑制T、B细胞增殖，减少主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类抗原表达，减轻局部炎症反应。TGF-β是放射致肺损伤过程中最重要的细胞因子，它可趋化炎症细胞、成纤维细胞，促进细胞合成IL-1、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)，同时还调节细胞外基质(extracellular matrix，ECM) 包括I、Ⅲ型胶原蛋白的合成增加，减少ECM的降解。BRP-39是存在于哺乳动物中的一种壳质酶类似物蛋白，被认为是在哺乳动物中的一种表型， 在小鼠称为BRP-39[10]， 在人的同系物则称为甲壳质酶蛋白-40(chitinase protein-40，YKL-40)，YKL-40表达和分泌的增加被认为与许多以组织重构、炎症反应和纤维化为特征的疾病相关，如哮喘、肺结节病、过敏性皮炎、肠道炎等炎症性疾病等。YKL-40能抑制氧化剂诱导的肺损伤，增加对Th2免疫的适应性，调节凋亡，刺激交替性巨噬细胞的活化，并促进组织纤维化和伤口愈合，其参与多种呼吸系统疾病的发病机制。与空白组小鼠相比，模型组小鼠肺组织的IL-6、IL-6 mRNA 、TGF-β1、TGF-β1 mRNA、BRP-39 mRNA含量显著升高，表明了SO2对肺组织细胞的致炎作用。中药预防组小鼠与模型组小鼠相比， TGF-β1、TGF-β1 mRNA、BRP-39 mRNA含量显著减少，说明肺痹汤2号对于小鼠肺损伤后炎症因子高表达有一定的抑制作用，表明肺痹汤2号对小鼠肺组织损伤起到了一定的保护作用。