转α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗T2代的生理生化特性分析

陈教云 KHANQaisar 韦江璐 唐丽华 董登峰 李杨瑞

摘  要：本研究对已获得的转α-微管蛋白基因SoTUA的T2代甘蔗株系进行PCR扩增及测序，从检测阳性的转基因甘蔗中选6个转基因株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）与非转基因野生型甘蔗对照（WT）进行了低温胁迫（4 ℃）处理，在处理0、5、10 d测定甘蔗叶片丙二醛（MDA）和渗透调节物（可溶性糖、可溶性蛋白）含量以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并采用RT-qPCR法分析了低温处理下甘蔗叶片α-微管蛋白基因的表达情况。结果表明：在4 ℃低温处理下，6个转SoTUA基因甘蔗与WT中α-微管蛋白的转录因子表达量随着胁迫时间的延长上调表达。胁迫后5、10 d转基因株系的相對表达量始终高于WT甘蔗，低温处理10 d时转基因T1显著高于其他株系（P<0.05）。在低温胁迫下，甘蔗的MDA含量逐渐增高，而转基因甘蔗增幅显著低于WT甘蔗，10 d时转基因株系MDA的含量比WT低41.77%（P<0.05）;POD活性在不同株系之间变化趋势不同，但转基因甘蔗POD活性显著高于WT甘蔗（P< 0.05）;转基因T1、T2、T4、T6株系的SOD活性随着胁迫天数增加呈现先增加后减少的趋势，而WT与转基因T3、T5的SOD活性逐渐升高;甘蔗的可溶性糖含量逐渐上升，转基因甘蔗的可溶性蛋白含量在0 d显著高于野生型甘蔗，胁迫后变化趋势在株系之间有所差异;转基因甘蔗SoTUA相对表达量与可溶性糖含量呈极显著的正相关。利用隶属函数综合分析评价，抗寒性排序结果为：T3>T2>T1>T5>T6>T4>WT。在低温胁迫下，转基因甘蔗SoTUA基因的上调表达能提高甘蔗的抗寒性，且具有遗传稳定性。

关键词：甘蔗;SoTUA基因;抗寒性;生理生化;遗传稳定性

中图分类号：S556.1      文献标识码：A

Abstract： Six SoTUA transgenic lines （T1， T2， T3， T4， T5， T6） were selected from the positive SoTUA transgenic sugarcane lines of T2 generation after PCR amplification and sequencing. The transgenic lines and control （wild type， WT） were treated with low temperature stress （4 ℃）， and the level of malondialdehyde （MDA） and osmotic adjustment substances （soluble sugar， soluble protein） and activities of peroxidase （POD） and superoxide dismutase SOD was were determined， and RT-qPCR analysis was done for SoTUA gene expression in sugarcane leaves at 0， 5 and 10 days of the treatment. The relative expression of α-tubulin transcription factor in the SoTUA transgenic sugarcane and WT was up-regulated， getting higher with the cold stress time under low temperature treatment at 4 ℃. The relative expression level was always higher in the SoTUA transgenic lines than that in WT at 5 and 10 days of the treatment. At the 10th day， the relative expression level of the transgenic line T1 was significantly higher than that of other transgenic strains （P<0.05）. The content of MDA increased gradually under cold stress， but it was found significantly lower in the transgenic sugarcane than that in WT by 41.77% （P<0.05）. The trend of POD activity varied among different lines， but it was higher in the SoTUA transgenic lines than in WT （P<0.05）. The SOD activity of transgenic lines T1， T2， T4 and T6 increased first and then decreased while SOD activity of WT and transgenic lines T3 and T5 increased gradually. The soluble sugar content increased gradually and the trend of soluble protein varied in different strains. The expression of SoTUA gene was positively correlated with soluble sugar. Using the membership function comprehensive analysis statistic method， the ranking result for cold resistance was obtained as T3 > T2 > T1 > T5 > T6 > T4 > WT. Up-regulated expression of SoTUA gene in the transgenic sugarcane could improve cold resistance， and the genetic stability is good.

Keywords： sugarcane; SoTUA gene; cold resistance; physio-biochemical characteristic; genetic stability

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.008

甘蔗（Saccharum spp. hybrids）是热带、亚热带作物，是最重要的糖料作物[1]。低温寒潮导致甘蔗生产和制糖工业发展受阻，经济受损[2-3]。培育甘蔗抗寒性品种是减缓低温损伤的重要途径，其研究倍受关注，然而传统的甘蔗育种方法周期长，无法满足经济快速发展的需求[4]。随着基因工程技术的不断成熟，各种优良的基因不断被发现和利用，为甘蔗抗寒育种提供了有效的途径[5]。

微管是细胞骨架的重要成分，植物微管由微管蛋白构建而成，包括α、β和γ 共3个亚基[6]。微管蛋白是信号转导和物质运输的通道，干扰微管的形成会影响与凋亡相关的信号通路转导，从而引起细胞凋亡[7]。近年来，关于微管与植物抗寒关系的研究受到高度重视。研究发现，温度是影响微管聚合状态的最敏感因素之一[8]。植物微管在低温胁迫下迅速解聚，通过调控微管蛋白改变其生理机能抵御低温[9]。Nyporko等[10]将嗜冷藻类Chloromonas绿单胞菌的α-微管蛋白268位氨基酸残基插入牛筋草微管蛋白序列中，使得该蛋白表面与绿单胞菌蛋白表面结构相似，结果发现，α-微管蛋白分子表面局部疏水性发生改变，认为其位点可提高植物的抗寒性。Schwarzerová等[11]研究表明，低温下烟草中细胞核内微管蛋白逐渐积累，复温后核内微管蛋白消失，核外微管蛋白重建。Bokros等[12]认为，微管蛋白的极端羧基末端是植物微管蛋白调节结构域的关键元件，低温下可调节植物微管稳定性。Paul等[13]从常绿树茶中克隆α-微管蛋白基因CsTUA发现，低温下α-微管蛋白表达上调，对维持细胞骨架稳定性起重要的作用。低温胁迫下，在黄瓜根尖细胞中不同部位的微管稳定性有所差异，且不抗寒品种冷稳定性明显低于抗寒品种，同时抗寒锻炼后微管蛋白的含量有所增加[14]。

随着TUA基因陆续报道，本课题组张保青[15]首次从甘蔗品种GT28叶片中克隆得到甘蔗α-微管蛋白基因SoTUA，对磷酸化位点分析发现，在低温下其位点能调节微管蛋白的稳定性。孙波[16]运用农杆菌介导法将SoTUA基因成功导入烟草品种K346和甘蔗品种ROC22中，通过PCR检测获得了T0代植株。唐丽华等[17]得到转α-微管蛋白基因SoTUA植株，低温胁迫下，转基因的植株的可溶性蛋白、可溶性糖的含量显著高于对照，MDA含量显著低于对照。本研究已获得的转SoTUA基因T2甘蔗株系需鑒定是否仍保持阳性，并需鉴定其遗传稳定性。因此对转SoTUA基因的甘蔗T2代株系进行低温处理，测定其生理生化特性，并检测SoTUA基因的表达，筛选出具有良好性状的转基因甘蔗株系，为转基因分子育种奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料为转α-微管蛋白基因SoTUA的T2代甘蔗（ROC22）6个株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）和非转基因甘蔗对照（WT）。

1.2  方法

试验于2018年在广西大学甘蔗研究所温室进行。选择无病害蔗茎切成单芽茎，用1%多菌灵灭菌30 min后放进沙盘进行沙培，待甘蔗长出2～3叶时，选取长势一致的甘蔗苗移栽桶中，每桶2株，每株系5桶。待甘蔗长至6～7叶时，放置于人工气候室[光照强度250～300 μmol/（m2·s）]，14 h光周期，相对湿度为60%～70%进行4 ℃低温处理，在处理0、5、10 d等3个时间点测定甘蔗+1叶各项生理生化指标和SoTUA基因表达量。

1.3  转基因甘蔗植株鉴定

1.3.1  甘蔗DNA提取  甘蔗移栽成活后，采集甘蔗+1叶，利用改进的SDS法提取甘蔗叶片总DNA[18]，用1%琼脂凝胶电泳检测DNA质量。

1.3.2  PCR检测  根据pCAMBIA3300载体[16]上的标记基因bar设计1对引物，分别为bar F（5-C?G?G-ATGAGCCCAGAACGACGCCC-3）和bar R（5- CGGTCAGATCTCGGTGACGGGCAC-3），扩增产物长度为549 bp。以提取的转基因甘蔗叶片DNA为模版，进行PCR检测。以pCAMBIA3300- SoTUA-Bar重组质粒作为阳性对照，甘蔗品种ROC22野生型植株（WT）为阴性对照，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测。切胶后使用胶回收试剂盒（Biospin Gel Extraction Kit，Bioflux公司）对PCR产物进行回收，并送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.4  转SoTUA基因甘蔗低温胁迫下基因的表达分析

1.4.1  总RNA的提取及cDNA的合成  采用Trizon试剂（康为世纪，中国）提取甘蔗叶片总RNA，具体操作按Trizon试剂盒说明书进行。以RNA为模板，参照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa，日本）进行，cDNA于80 ℃保存。

1.4.2  低温胁迫处理下SoTUA基因的RT-qPCR分析  以转基因甘蔗株系及野生型（WT）甘蔗不同处理天数（0、5、10 d）叶片的cDNA为模板，以甘蔗GADPH基因作为内参[16]，SoTUA为目的基因，采用Primer Express 3.0分别设计引物并进行筛选。内参基因和SoTUA基因的基因荧光定量的引物见表1。

1.4.3  低温胁迫处理对转基因甘蔗株系中SoTUA基因的RT-qPCR分析  分析采用SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa，日本）试剂盒，共20 μL体系包括cDNA模板（50 ng/μL） 2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa，日本）10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.8 μL，RNase Free ddH2O 6.4 μL。内参和目的基因分别设技术重复3次。参照张保青[15]报道利用2CT法计算相对表达量。

1.5  测定项目及方法

可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[19]，可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝法[19]测定，丙二醛（MDA）含量采用TCA法测定[20]，超氧化物歧化酶（SOD）活性用NBT化学还原法测定[20]，过氧化物酶（POD）活性用愈创木酚法测定[21]，均以鲜重计。

1.6  数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件计算实验数据并制作出柱状图，利用SPSS20.0统计软件对低温胁迫0、5、10 d的α-微管蛋白表达量与各生理指标进行相关性分析[22]，在P<0.05水平上进行方差分析。运用隶属函数分析低温胁迫10 d时各生理指标的结果，进行转基因6个株系和对照的抗寒性的综合评价[15]，计算方法如下：

2.2  PCR检测结果

甘蔗PCR结果如图2所示，在正对照和转基因株系条带在549 bp位置，H2O与野生型甘蔗549 bp无条带，出现2条带的原因可能是由于引物特异性较差。将转基因PCR 549 bp处产物经胶回收纯化后测序，结果显示与目的基因扩增片段的序列一致，说明6个甘蔗株系均为转SoTUA基因甘蔗。

2.3  RNA提取结果

琼脂糖凝胶电泳检测结果（图3）所示，WT野生型甘蔗和6个转基因甘蔗株系28S与18S、5S条带清晰、锐利、无拖尾弥散现象，可进行后续实验。

2.4  低温胁迫下SoTUA基因RT-qPCR分析

如图4所示，随着低温胁迫的时间增加，WT和转基因株系的SoTUA基因的相对基因表达量均呈上调表达，总体上变化趋势一致，其中在0～5 d上调表达较为缓慢，5～10 d上调表达急剧;0 d时，T4表达量最高，T4、T6显著高于野生型甘蔗;处理5 d时，WT的SoTUA基因的相对表达量低于转基因株系，且与T1、T2、T3、T4、T6株系达到显著性差异（P<0.05）;10 d时，所有转基因株系的SoTUA基因表达量高于WT，其中T1和T3表达量分别是WT的2.2和1.7倍。

2.5  低温胁迫下转SoTUA基因甘蔗的生理生化变化

2.5.1  低溫胁迫下甘蔗叶片可溶性糖含量的变化  由图5可知，在低温胁迫下，WT和转基因甘蔗的可溶性糖含量均呈上升的趋势，上升的幅度随胁迫时间不断增大，株系与株系之间上升幅度有所不同。0 d时，WT可溶性糖含量显著高于转基因甘蔗T1、T2、T3、T4、T6，与T5无显著性差异。5 d时，转基因甘蔗T2可溶性糖含量显著高于WT，是WT的1.7倍。在10 d时，转基因株系T2、T3的可溶性含量急剧增加，显著高于WT，分别是WT的3.2和2.6倍;转基因株系T1、T5、T6与WT可溶性糖含量增加缓慢，无显著性差异;WT的可溶性糖含量显著高于转基因株系T4。

2.5.2  低温胁迫下甘蔗叶片可溶性蛋白含量的变化  如图6所示，在低温胁迫下，不同株系甘蔗的可溶性蛋白含量的变化趋势各有不同，野生型甘蔗WT、转基因甘蔗株系T1、T3、T5、T6的可溶性蛋白含量逐渐降低，转基因株系T2、T4呈现先降低后增高的趋势。在0 d时，WT的可溶性蛋白含量与转基因株系T1无显著差异，但显著低于其他转基因株系;5 d时，转基因株系T3、T6的可溶性蛋白含量显著高于其他株系，分别是WT的1.5、1.4倍，而转基因株系T2、T4显著低于WT;10 d时，与5 d相比转基因株系T1、T3、T6的可溶性蛋白含量略有下降，转基因株系T2、T4分别为5 d时的1.6、1.9倍，转基因株系T1、T2、T3、T6显著高于WT。

2.5.3  低温胁迫下甘蔗叶片MDA含量的变化  如图7所示，在0 d时，转基因株系T6的MDA含量显著大于其他株系，而其他株系间无显著性差异。低温处理后，WT和转基因株系的MDA含量总体呈一个上升的趋势，5 d时，WT的MDA含量显著高于转基因甘蔗T2、T4、T5、T6;10 d时，WT的MDA含量急剧升高，是5 d的1.7倍，且显著高于转基因株系，转基因株系T3的略下降，而在转基因株系中T5的MDA含量较高，与其他转基因株系无显著性差异。

2.5.4  低温胁迫下甘蔗叶片POD活性的变化  由图8可知，在低温胁迫下，转基因甘蔗和WT叶片的POD活性均呈下降的趋势。在低温处理0 d时，转基因株系T1、T2、T5、T6的POD值显著高于WT、T3、T4。在5 d时，转基因甘蔗T1、T2、T3、T5、T6的POD活性显著高于野生型WT，其中转基因T1的POD值是WT的1.6倍，且显著高于其他转基因株系。10 d时，转基因株系T3的POD活性急剧下降，且显著低于WT和其他转基因株系;转基因T5的下降较缓慢，仍显著高于WT，是WT的1.8倍。

2.5.5  低温胁迫下甘蔗叶片SOD活性的变化  由图9可知，在低温胁迫下，转基因甘蔗T1、T2、T4、T6株系呈现先升高后下降的趋势，而野生型甘蔗、转基因T3、T5株系则呈现上升的趋势。在0 d时，转基因甘蔗T1的SOD活性显著高于WT，而野生型甘蔗SOD活性显著高于T2、T3、T4、T5、T6;5 d时，转基因甘蔗株系T2、T4、T5的SOD活性急剧升高，且显著高于WT，分别是WT的2、2.7、1.4倍;10 d时，转基因株系T5的SOD活性达到最大值，与WT、T4无显著性差异，而T2达到最小值，显著小于WT。

2.6  不同株系的耐寒性综合评价

2.6.1  甘蔗叶片各生理生化指标的相关分析  由表2反映了低温处理0、5、10 d的SoTUA基因相对表达量、MDA含量、SOD活性、POD活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量6个指标间的相关性。由表2可知，在整个低温期间，SoTUA基因相对表达量与可溶性糖含量呈极显著正相关，与可溶性蛋白含量、POD活性呈负相关，与SOD活性呈正相关但不显著，与MDA含量呈显著正相关;可溶性蛋白含量与SOD活性呈极显著负相关，与POD活性呈显著正相关;POD活性与可溶性糖含量、丙二醛含量呈显著负相关。

2.6.2  隶属函数综合评价  植物抗寒能力的强弱是由多种因素相互作用协同调控的，综合评估多个指标可以弥补单因素评价的片面性，综合反映植物的抗寒性。本研究应用处理10 d时的超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、过氧化物酶活性、丙二醛含量指标的测定值，利用隶属函数对不同甘蔗株系进行抗寒性的综合评估。计算结果SOD活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、POD活性、MDA含量的权重系数分为20.17、23.90、15.21、22.34、17.96，其中可溶性蛋白的权重系数最大，说明可溶性蛋白对转基因甘蔗抗寒能力影响最大。研究表明，按照综合评价值，各品系抗寒性强弱排序为T3>T2>T1> T5>T6>T4>WT。综合评价值反映了植株的抗寒能力强弱，数值越大抗寒能力越强。

3  讨论

低温是影响植物生长的重要非生物因素之一，植物在低温胁迫下，激活和诱导体内的各信号通路，调控相关基因的表达抵抗胁迫[23]。植物受到胁迫时，抗性强的植株微管会瞬间解聚与重组来抵御低温，微管稳定性越高[24-25]，抗寒能力越強，使用微管解聚药剂可以提高植物抗寒能力[26]。张保青[15]研究表明，甘蔗在低温诱导下，SoTUA表达量上升，并且抗寒品种比不抗寒品种SoTUA表达量高。孙波[16]发现，过量表达α-tubulin能提高烟草耐低温性。杨洪等[27]从巴西橡胶树克隆出HbTUA2基因，并发现在低温下HbTUA上调表达。本研究中，随着低温处理的时间延长，甘蔗SoTUA基因相对表达量不断升高，5 d和10 d时，转基因甘蔗比野生型甘蔗的SoTUA基因相对表达量高，其中转基因甘蔗T1株系在低温处理10 d表达量最高，T6表达量最低。不同株系SoTUA的表达量有所区别，这可能与SoTUA基因的拷贝数和整合方式有关，需进一步研究。

微管的动态调节特性对细胞骨架重排、细胞内物质运输等生理生化活动起重要调节作用[28]。植物在低温锻炼过程中改变生理和代谢从而适应低温[29]。可溶性糖和可溶性蛋白是植物细胞中2个重要的渗透调节因子，并能保持细胞渗透平衡[30]。植物在低温下大量积累可溶性糖和可溶性蛋白来提高细胞液浓度，增强植物保水能力，抵抗低温。在低温胁迫下，甘蔗的可溶性糖含量逐渐升高，抗寒性品种增幅较大[31];甘蔗不抗寒品种可溶性蛋白含量逐渐降低，而抗寒品种可溶性蛋白含量变化幅度不大[32]。本研究中，在低温胁迫下，甘蔗可溶性糖含量逐渐增加，与刘光玲[33]研究一致，其中转基因T2与T3增幅最大，不同株系间增幅不同，以野生型增幅较小;可溶性蛋白含量在转基因株系中变化趋势各不相同，野生型甘蔗可溶性蛋白逐渐减少，而转基因甘蔗株系T1、T3、T6的可溶性蛋白含量在整个处理时期变化相对稳定。本研究中，0 d时，转基因株系可溶性蛋白含量显著高于野生型甘蔗，可能SoTUA基因过表达使得甘蔗叶片中的可溶性蛋白增加，随着胁迫时间的增加，各株系变化趋势没有明显的规律，推测可能为SoTUA基因插入位点不同，但具体的作用机理需要进一步的研究。

植物受到逆境胁迫时，发生膜脂过氧化反应，生成MDA产物，具有细胞毒性[34]。膜的稳定性是植物冷适应最主要的特征[35]。在整个低温锻炼过程中，甘蔗的MDA含量总体呈上升的趋势，这与何晓童等[36]报道低温胁迫下红芸豆MDA含量增加的结果一致。本研究中，WT的MDA含量在5到10 d时急剧升高，说明甘蔗受到胁迫时，细胞膜系统受到损害，WT甘蔗活性氧的生成速率大于保护酶的清除速率，导致MDA含量快速升高，而转基因甘蔗MDA含量相对稳定，膜脂受氧化程度较小，说明转基因甘蔗中SoTUA基因过表达起到了积极的作用。

SOD和POD是植物体内主要的抗氧化酶，其活性的变化可以反映植物抗逆能力[37-38]。植物受到逆境胁迫时，SOD 活性会迅速升高来清除超氧阴离子自由基保护细胞膜[39]。低温胁迫初期，转基因甘蔗与野生型甘蔗的SOD活性呈上升趋势，转基因甘蔗T2、T4、T5的SOD活性增幅显著高于野生型，推测过量甘蔗表达SoTUA基因对低温胁迫初期SOD的活性影响较大。在低温处理前后，野生型甘蔗SOD活性上升，说明甘蔗的SOD对低温胁迫做出了应激反应，而10 d时，转基因甘蔗T1、T2、T3、T6的SOD活性和处理前的变化较小，酶的活性也显著没有野生型高，说明SOD感知低温信号能力较弱，原因有待进一步研究。冷胁迫过程中植物体内产生POD氧化分解过氧化氢等毒性物质[40]。本研究中，在低温胁迫前后，甘蔗POD活性总体上呈下降趋势，这与Tanha等[41]发现毛苕子种子在低温下POD活性降低的结果一致。0 d时，转基因T1、T2、T5、T6的POD活性显著高于其他株系，且显著高于野生型甘蔗，推测SoTUA在0 d时下对甘蔗的POD的活性有促进作用，随着胁迫时间的延长，野生型甘蔗POD活性逐渐下降，而转基因甘蔗的相对稳定，说明SoTUA在细胞内起保护性的作用，从而提高甘蔗耐寒性。

在低温处理下，不同转基因甘蔗株系的酶活变化趋势各不相同。相关性分析结果[42]表明，SoTUA基因的相对表达量与可溶性糖含量呈极显著正相关，推测微管参与糖的信号传导，SoTUA基因的过表达有利于可溶性糖的积累。应用隶属函数分析法[43-44]，对转基因和野生型甘蔗进行排序，抗寒性强弱依次是T3>T2>T1>T5>T6>T4> WT，反映了不同转基因甘蔗株系的抗寒能力。

4  结论

转基因SoTUA甘蔗在低温下SoTUA基因上调表达可提高甘蔗抗寒能力，且转SoTUA基因甘蔗T2代具有遗传稳定性。这为深入研究SoTUA在甘蔗抗寒作用的机理研究提供了参考，为筛选出稳定遗传的优良转基因甘蔗株系提供了理论依据和育种材料。

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