ACK1在子痫前期孕妇胎盘中的表达及其对滋养细胞侵袭功能的调控

唐玉艳

南华大学附属长沙中心医院妇产科,湖南省长沙市 410000

子痫前期(PRE-eclampsia, PE)是一种发生在孕产妇妊娠期的全身综合性疾病，主要发生在妊娠20周之后，主要特征和表现为高血压与蛋白尿，常累及重要器官导致多系统并发症，发病率可达5%～8%，是导致孕产妇及胎儿死亡的一种主要原因[1-2]。ACK1全称为活化的Cdc42结合激酶(Activated Cdc42-binding Kinase)，其基因位于人染色体3q29，蛋白分子全长1 091个氨基酸，相对分子质量约为120 000[3]。ACK1作为非受体酪氨酸激酶，通过SAM、Rac、SH3等多个结构域发挥生物学功能[4]。有研究表明ACK1诱导Cdc42调节细胞运动、肿瘤迁移与侵袭，与恶性肿瘤发展和预后有密切相关[5]。因滋养细胞生物学特性类似于肿瘤细胞，本研究推测ACK在调控滋养细胞功能方面具有一定联系。本研究通过探究ACK1在足月与PE胎盘表达情况及对滋养细胞侵袭功能的影响，取得了较好的效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年8月1日—2018年8月1日于本院产科计划行剖宫产手术的32例子痫前期孕妇作为研究组，并选取同期32例正常足月孕妇作为对照组，分别收集两组胎盘组织。符合《2014年ACOG关于妊娠期高血压指南》子痫前期诊断标准[6]。纳入本研究的孕妇在年龄、孕周、身高及体重等基本信息正常，月经规律，第一次妊娠单胎且过程正常，除子痫前期外排除任何合并症(原发性高血压，心、肝、肾病，糖尿病及癌症等)与并发症。本研究经本院伦理委员会审批通过，且所选孕妇均签订知情同意书。两组孕妇上述一般资料经比较，无统计学差异(P>0.05)，具可比性。

1.2 细胞和主要试剂 滋养细胞HTR-8/SVneo(美国典型培养物保藏中心)，通过含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于 5% CO2饱和湿度恒温箱中37℃条件下进行常规培养，待细胞长满至约80%时予以传代，选取对数生长期细胞参与实验。TRIzol和LipofectamineTM2000(Invitrogen，美国)，ACK1 (SC-323, Santa Cruz Biotechnology, Inc)，一抗 MMP-9、TIMP-2 以及 HRP 标记的二抗(Abcam，美国)，Transwell 小室(Millipore，美国)，流式细胞仪(BD，美国)。

1.3 方法 本研究中以滋养细胞株(HTR8/SV neo)作为实验研究细胞系，分为常氧对照组(A组)、缺氧/富氧组(B组)及ACK1基因序列慢病毒敲降组(C组)，具体处理方式如下。A组：采用完全培养基(RPMI 1640 90%，FBS 10%)于5%CO2、20%O2、37℃下培养。B组：常氧培养条件下转染含ACK1敲降序列的慢病毒(购于上海吉玛生物有限公司)[7]。C组：于2%O2培养箱中进行缺氧培养8 h后，转移至常氧条件(20%O2)培养16 h，共计2个循环[8]。采取免疫组化(IHC)和蛋白免疫印迹法(WB)检测胎盘组织中ACK1的表达情况。通过Transwell实验分析检测各组细胞的侵袭情况。使用Western blot检测各组细胞中ACK1蛋白、金属蛋白质酶(MMP)-9及其特异性抑制因子(TIMP)-2的蛋白表达差异。

2 结果

2.1 ACK1在研究组和对照组孕妇胎盘组织中表达的比较 通过IHC检测，对照组中ACK1表达显著，定位主要显示在滋养细胞中，详见图1。通过对两组孕妇胎盘组织进行Western Blot分析，研究组胎盘组织中ACK1的表达含量明显低于对照组(P<0.05)。详见图2、表1。

图1 ACK1在研究组和对照组孕妇胎盘中IHC检测结果

图2 研究组和对照组孕妇胎盘组织Western Blot分析结果

表1 ACK1在研究组和对照组孕妇胎盘中表达的比较

2.2 ACK1在缺氧/富氧(H/R)及ACK1基因序列慢病毒敲降(ACK1敲降)处理后滋养细胞中的表达 C组转染HTR-8/SVneo细胞效率为99.81%，可供后续研究使用。通过定量分析，H/R和ACK敲降能够使HTR-8/SVneo细胞ACK1表达水平分别降低66%和73%，详见表2。

表2 A、B、C三组滋养细胞中ACK1的表达比较

2.3 ACK1敲降对滋养细胞侵袭功能的影响 A组未经处理HTR-8/SVneo细胞穿透入小室细胞数为112.315±9.877，B组经过H/R处理穿透入小室细胞数为36.423±6.871，C组经ACK1敲降穿透入小室的细胞数为28.971±3.541。B组、C组与A组相比穿透入小室细胞数明显降低，表明侵袭能力显著降低。此外，B组和C组均能够减弱MMP-9的表达，同时增强TIMP的表达，详见表3。

表3 A、B、C三组MMP-9和TIMP-2表达水平比较

3 讨论

有研究显示，在多种恶性肿瘤组织中ACK1表达量明显升高，ACK1可以催化某些蛋白酪氨酸磷酸化成活化蛋白，使其发挥作用，直接促进细胞增殖、迁移和侵袭能力[9]。但ACK1在子痫前期研究中研究较少，本文研究结果显示，研究组胎盘组织中ACK1的表达含量明显低于对照组，因而推测ACK1表达含量降低与发生子痫前期相关。

在孕妇妊娠经过中，滋养细胞通过侵袭子宫蜕膜和子宫螺旋动脉，形成滋养细胞通道，血管的内皮细胞被取代，血管由狭窄、弹性转变成扩张并无弹性的子宫胎盘血管，子宫螺旋动脉重铸完成，血供能力增加，使绒毛间隙的血流量明显升高，以保证胎盘功能正常[10]。子宫螺旋动脉重铸过程中保持滋养细胞侵袭和增殖能力正常是最为关键的一环。在各种条件变化的影响下，滋养细胞增殖和侵袭能力降低，直接影响到子宫螺旋动脉重铸过程，影响血流量的供应，进而诱导氧化应激反应物(ROS)升高，可能与子痫前期发病相关联[11]。本研究中，采取对HTR-8/SVneo细胞进行H/R处理，ROS水平显著升高，以此来模拟滋养细胞的H/R状态。本研究显示，通过对HTR-8/SVneo细胞分别进行H/R和ACK1敲降处理，二种处理方式均能够使ACK1表达能力降低，且HTR-8/SVneo细胞的侵袭功能受到很大程度的抑制；表明ACK1基因表达能力的下降显著抑制滋养细胞的侵袭功能，同时表明ACK1可能与子痫前期发病有关。MMP-9隶属于金属蛋白质酶的一种，起到降解细胞基膜的作用，在调控肿瘤细胞的侵袭功能方面具有关键作用。有关于肿瘤细胞体外研究表明，ACK1表达量提高的同时会提升肿瘤细胞MMPs的表达水平，通过降解细胞基膜浸润周围组织[12]。本研究结果显示，通过对HTR-8/SVneo细胞分别进行H/R和ACK1敲降处理后，细胞侵袭能力降低的同时，二种处理方式下细胞中MMP-9表达能力均下降，对应TIMP-2水平提高。

综上，子痫前期孕妇胎盘ACK1表达水平下降可使滋养细胞的侵袭功能降低，血管重铸功能减弱，导致子痫前期发病。