芝麻粕蛋白酶法提取工艺优化及组分分析

皮诗宇，王常高，杜 馨，蔡 俊

（湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室工业微生物湖北省重点实验室工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉 430068）

芝麻（Sesamum indicumL.）是一种被广泛利用的油料种子作物，属胡麻科（Pedaliaceae）胡麻属（Sesamum），是胡麻的籽种，我国四大食用油料作物之一[1-2]。芝麻提油后的副产物称为芝麻粕，其中含有丰富的蛋白质[3]。芝麻粕中蛋白质平均含量为42.5%～47.9%[4]，营养价值较高，具有良好的乳化性、乳化稳定性、吸油性、起泡性及泡沫稳定性等功能特性[5-6]。但芝麻在利用传统方法提油后，得到的芝麻粕蛋白变性严重，并且残留的油脂和纤维素形成物理屏障作用造成芝麻粕蛋白利用困难[7]，一直被作为劣质饲料或废物，造成资源的浪费。

当今日益增长的食物资源供给需求矛盾，开发新的蛋白质资源并合理利用迫在眉睫，尤其是植物性蛋白资源的开发利用已成为世界各国解决食物资源匮乏的重要途径。花生蛋白、玉米蛋白和大豆蛋白已经普遍应用于市场中，但对芝麻粕蛋白的利用还没有引起足够的重视[8]。目前，芝麻粕蛋白的提取方法[9-11]对其提取率影响较大，生物法提取的芝麻粕蛋白含量较高[12-13]，但植物蛋白结构复杂，相对分子质量较大，不易于人体的消化吸收；通过酶解制备蛋白多肽有利于人体的吸收，并具有抗氧化、降血压、提高机体免疫力的生理功能[14]。近年来研究发现，表面活性剂与蛋白质同时存在时可以竞争吸附蛋白质，使乳状液不稳定，继而过滤除油[15-16]。同时，表面活性剂能降低酶解过程木质素对酶的非特异性吸附，从而提高酶解效率[17]。

本研究以芝麻粕为原料，采用表面活性剂吸附油脂法对芝麻粕进行脱脂预处理，并结合水剂法去除表面活性剂，得到蛋白质含量较高的芝麻粕。但蛋白质的分子质量较大，不利于其在医药、食品等方面的应用，因此，选取最佳蛋白酶对芝麻粕蛋白进行水解，并利用单因素轮换法和正交试验提高芝麻粕蛋白溶出率，确定最佳酶解条件。最后，利用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析水解产物中氨基酸的含量及组成，以期为后续开发利用芝麻粕提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芝麻粕：市售；碱性蛋白酶（10万U/g）、中性蛋白酶（10万U/g）：诺维信生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（80万U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；吐温80、十二烷基硫酸钠、石油醚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硬脂酸（分析纯）：上海三消化工有限公司；氨基酸标准品：武汉市华顺生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

KDN-12C消化炉、KDN-1000全自动定氮仪：上海昕瑞仪器仪表有限公司；FD-2型真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；DD5M型低速大容量多管架离心机：长沙平凡仪器有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司；LC-20AD型高效液相色谱仪：日本SHINADZU公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芝麻粕主要成分分析

灰分含量：参照GB5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》测定[18]；粗纤维含量：参照GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》测定[19]；还原糖含量：参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》测定[20]；脂肪含量：参照GB5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》测定[21]；总蛋白含量：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定[22]；水分含量：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定[23]。

1.3.2 芝麻粕脱脂处理[24-27]

选用硬脂酸、十二烷基硫酸钠和吐温80作为芝麻粕脱脂预处理所用脱脂剂，反应结束后利用水剂法去除溶液中的脱脂剂，得到蛋白含量较纯的芝麻粕。

称取一定量的未脱脂芝麻粕，测定粗脂肪含量（m1）。称取3份未脱脂芝麻粕5.00 g，粉碎，加入100 mL蒸馏水，分别加入1%的吐温80、十二烷基硫酸钠、硬脂酸，在50 ℃磁力搅拌水浴锅中恒温加热，浸提时间30 min。脱脂反应结束后在4 000 r/min条件下离心15 min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗3次，置于烘箱中烘干。取出一定量的脱脂芝麻粕，测定脱脂后样品中的脂肪含量（m2）及蛋白含量，计算3种表面活性剂处理芝麻粕的脱脂率，比较吐温80、十二烷基硫酸钠、硬脂酸的脱脂效果，选择脱脂效果最好的表面活性剂作为芝麻粕脱脂剂。

脱脂率计算公式如下：

1.3.3 芝麻粕蛋白水解酶的选择

称取3份脱脂芝麻粕样品10 g，按料液比1∶4（g∶mL）加入蒸馏水制备悬浊液，分别加入脱脂芝麻粕质量的0.01%的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶。按各酶的适宜pH值、温度水解5 h后，8 000 r/min离心15 min，取上清液，采用凯氏定氮法[22]测定可溶性蛋白含量，计算芝麻粕蛋白溶出率，选择最优芝麻粕蛋白水解酶。蛋白质溶出率计算公式如下：

1.3.4 芝麻粕蛋白酶解条件优化单因素试验

选取最优水解蛋白酶，确定蛋白酶的初始水解条件为料水比1∶8（g∶mL），酶解时间5 h，酶解温度40 ℃，加酶量0.01%。在此基础上，采用单因素轮换法依次考察酶解时间为（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、料水比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）、酶解温度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）及加酶量（0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%）对芝麻粕蛋白溶出率的影响，确定最适酶解条件。

1.3.5 芝麻粕蛋白酶解条件优化正交试验

在单因素试验的基础上，以酶解温度（A）、酶解时间（B）、料水比（C）、加酶量（D）为考察因素，蛋白质溶出率（Y）为评价指标，选择L9（34）正交表进行4因素3水平正交试验优化，试验因素与水平见表1。

表1 碱性蛋白酶水解芝麻粕蛋白条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for hydrolysis conditions optimization of protein from sesame meal by alkaline protease

1.3.6 芝麻粕蛋白水解物组成成分分析

采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法检测芝麻粕蛋白水解物中的游离氨基酸[28]。

检测条件：流动相A为0.04 mol/L无水乙酸钠溶液，流动相B为体积分数为50%的乙腈水溶液，检测波长为360 nm，流速为1 mL/min，色谱柱为C18VP-ODS（5 μm，250 mm×4.6 mm），梯度洗脱：0～20 min，70%A；20～26 min，64%A；26～41 min，45%A；41～46 min，35%A；46～48 min，10%A；48～54 min，2%A；54～60 min，30%A。

根据保留时间定性，采用外标法定量。

1.3.7 数据处理

采用SPSS 20.0软件设计正交试验方案，采用Excel 2013版软件作图。

2 结果与分析

2.1 芝麻粕原料的主要成分分析

芝麻粕原料的主要成分见表2。

表2 芝麻粕的主要成分Table 2 Main components of sesame meal

由表2可知，芝麻粕中灰分和粗纤维含量较高，分别为14.05%和17.11%。植物纤维素可作为一种可再生原料，被再加工成甜味素等功能材料[29]；灰分含量较高表明芝麻粕中矿物质元素丰富，含有的矿物元素中铁含量丰富[30]，可用于人体的生长发育。由此可知，芝麻粕有很好的利用价值。芝麻粕中粗蛋白含量最高（42.21%），较豆粕中蛋白质含量高9%[31]，较棉籽饼粕中蛋白含量高5%[32]，可作为蛋白质资源利用。但芝麻粕中含有3.98%的脂肪，该脂肪是芝麻在榨油后残留的，油相将芝麻粕蛋白包裹也是造成芝麻粕蛋白提取困难的原因之一。因此，本试验针对芝麻粕进行脱脂预处理，提高芝麻粕蛋白提取率。

2.2 3种表面活性剂脱脂效果的比较

芝麻粕是芝麻压榨生产油料后的废弃物，其中残留部分油脂，如果酶解产物含有较多的脂肪会造成其在温度较高时容易焦化，并对氮含量的测定结果有一定的影响。因此，先将芝麻粕脱脂，脱脂后利用水剂法[27]除去脱脂剂，得到蛋白质含量较纯的芝麻粕。比较3种表面活性剂对芝麻粕脱脂率的影响，结果见表3。

表3 3种表面活性剂对芝麻粕脱脂率的比较Table 3 Comparison on degreasing rates of 3 surfactants on sesame meal

由表3可知，吐温80的脱脂效果最好，脱脂率达93.49%；其次是十二烷基硫酸钠，脱脂率为92.39%；硬脂酸的脱脂率仅为51.51%。脱脂后得到的芝麻粕蛋白含量与表面活性剂性能有关，使用吐温80脱脂后，芝麻粕蛋白质含量提高7.31%。吐温80作为非离子型表面活性剂与阴离子型表面活性剂相比，稳定性高，具有高表面活性、水溶液的表面张力低、临界胶束浓度低、胶束聚集数大、增溶作用强以及良好的乳化力和去污力，是提高芝麻粕蛋白质含量的主要原因[26]。因此，选用脱脂效果最好的吐温80作为芝麻粕的脱脂剂。

2.3 芝麻粕蛋白水解酶的选择

不同蛋白酶对芝麻粕蛋白的酶解效果见表4。

表4 不同蛋白酶对芝麻粕蛋白的酶解效果比较Table 4 Comparison of enzymatic hydrolysis effects of different proteases on protein from sesame meal

由表4可知，碱性蛋白酶对芝麻粕蛋白酶解后的芝麻粕蛋白溶出率最高，为72.61%，其次为木瓜蛋白酶（70.23%），中性蛋白酶最差（66.62%）。分析原因可能是芝麻粕蛋白在碱性溶液中的溶解度较大[13]，酶能充分与蛋白接触进行酶解。因此，选定碱性蛋白酶最佳。

2.4 碱性蛋白酶酶解芝麻粕蛋白条件优化单因素试验

2.4.1 酶解时间对芝麻粕蛋白溶出率的影响

酶解时间对芝麻粕蛋白溶出率的影响见图1。

图1 酶解时间对芝麻粕蛋白溶出率的影响Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the dissolution rate of protein from sesame meal

由图1可知，随着酶解时间的增加，芝麻粕蛋白溶出率也随之增加，当酶解时间为4 h时，芝麻粕蛋白溶出率最高并趋于稳定，为70.25%。酶解时间过短会造成芝麻粕蛋白无法完全酶解，导致芝麻粕蛋白溶出率不高；当芝麻粕蛋白酶解完毕后酶解过程将终止，酶解时间过长会降低生产效率。因此，确定芝麻粕蛋白的最佳酶解时间为4 h。

2.4.2 料水比对芝麻粕蛋白溶出率的影响

料水比对芝麻粕蛋白溶出率的影响见图2。

由图2可知，随着料水比的减小，芝麻粕蛋白溶出率随之增加，当料水比达到1∶10（g∶mL）时，芝麻粕蛋白溶出率达到最高，为71.21%。料水比较大时，碱性蛋白酶与芝麻粕蛋白没有足够的接触面积，影响芝麻粕蛋白溶出率；当料水比达到1∶10（g∶mL）后，此时的料水接触面积达到饱和，进一步减小料水比并不会导致芝麻粕蛋白溶出率增大，反而会增加工艺成本。因此，确定料水比为1∶10（g∶mL）。

图2 料水比对芝麻粕蛋白溶出率的影响Fig.2 Effect of material to liquid ratio on the dissolution rate of protein from sesame meal

2.4.3 酶解温度对芝麻粕蛋白溶出率的影响

酶解温度对芝麻粕蛋白溶出率的影响见图3。由图3可知，随着酶解反应温度的升高，芝麻粕蛋白溶出率呈现先上升后下降的趋势，当酶解温度达到50 ℃时，芝麻粕蛋白溶出率达到最大，为79.20%。这主要是因为碱性蛋白酶的酶活受温度影响，在最适温度范围内，酶活随温度的升高而增大，超过酶活最适温度时，酶活随温度的升高而降低。因此，确定芝麻粕蛋白的最佳酶解温度为50 ℃。

图3 酶解温度对芝麻粕蛋白溶出率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the dissolution rate of protein from sesame meal

2.4.4 加酶量对芝麻粕蛋白溶出率的影响

加酶量对芝麻粕蛋白溶出率的影响见图4。由图4可知，随着加酶量的增加，芝麻粕蛋白溶出率随之增加，当加酶量为0.03%时，芝麻粕蛋白溶出率达到最大，为87.61%。确定酶解底物浓度后，增加酶量会使芝麻粕蛋白溶出率提高，当底物消耗完毕反应终止，继续增加酶量不会提高芝麻粕蛋白溶出率，并且会造成资源浪费。因此，确定加酶量为0.03%。

图4 加酶量对芝麻粕蛋白溶出率的影响Fig.4 Effect of enzyme addition on the dissolution rate of protein from sesame meal

2.5 碱性蛋白酶酶解芝麻粕蛋白条件优化正交试验

在单因素试验的基础上，以酶解温度（A）、酶解时间（B）、料水比（C）、加酶量（D）为考察因素，以芝麻粕蛋白溶出率（Y）为考察指标，进行4因素3水平正交试验，结果与分析见表5，方差分析结果见表6。

表5 碱性蛋白酶水解芝麻粕蛋白条件优化正交试验结果与分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for hydrolysis conditions optimization of protein from sesame meal by alkaline protease

表6 正交试验结果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal tests results

由表5及表6可知，各因素对芝麻粕蛋白溶出率影响的主次顺序为B＞A＞C＞D，即酶解时间＞酶解温度＞料水比＞加酶量，根据F比和P值可知，酶解温度、酶解时间和料水比的影响较为显著。最优水平组合为A2B1C2D3，即酶解温度50 ℃、酶解时间3 h、料水比1∶10（g∶mL）、加酶量0.04%，与试验组最优组合一致，在此条件下芝麻粕蛋白溶出率可达88.94%。与仅利用蛋白酶直接酶解芝麻粕对比[33]，利用表面活性剂预处理后，再使用碱性蛋白酶酶解法得到的芝麻粕蛋白溶出率提高18.58%；并且吐温80作为表面活性剂价格低廉，能在今后的工业化中起到较好的作用。

2.6 芝麻粕蛋白水解物组成成分分析

2.6.1 芝麻粕蛋白水解物中氨基酸组成分析

芝麻粕蛋白水解物中氨基酸的组成及含量见表7。

表7 芝麻粕蛋白水解物的氨基酸组成与含量Table 7 Composition and contents of amino acid in protein from sesame meal hydrolysate

由表7可知，芝麻粕蛋白水解物中含有20种氨基酸，8种人体必需氨基酸。其中酪氨酸含量（33.01 g/100 g）最高，占总氨基酸含量的21.65%，酪氨酸可用作氨基酸类药、营养增补剂等工业生产；其次是半胱氨酸和甲硫氨酸，约占总氨基酸含量的13%～14%，其中半胱氨酸可用于面包、天然果汁中防止食品老化；甲硫氨酸是氨基酸输液和综合氨基酸制剂的主要组成之一[34]，价格低廉。但本试验与SINGH K K等[35]的研究结果相比，赖氨酸和谷氨酸含量较低，酪氨酸和甲硫氨酸含量较高，分析原因可能是由于芝麻生长环境、遗传等其他不可控因素造成的。

2.6.2 芝麻粕蛋白水解物中必需氨基酸组成分析

芝麻粕蛋白水解物与不同种类蛋白质成分中人体必需氨基酸组成及联合国粮农组织（food and agriculture organization of the united nations，FAO）/世界卫生组织（world health organization，WHO）推荐值的对比与分析见表8。

由表8可知，芝麻粕蛋白水解物中人体必需氨基酸占总氨基酸的质量分数基本高于菜籽粕分离蛋白和花生饼粕分离蛋白的质量分数，其中甲硫氨酸＋半胱氨酸的含量最高，占总氨基酸含量的28.3%，明显高于FAO/WHO的推荐值（3.5%）；缬氨酸和异亮氨酸含量均高于其他两种分离蛋白氨基酸含量，缬氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸的注射液能治疗肝功能衰竭以及器官损伤；但苏氨酸含量低于其他两种蛋白氨基酸含量，且含量低于FAO/WHO推荐值（4.0%），因此，芝麻粕蛋白水解物不能应用于制备有关苏氨酸的产品。综上所述，芝麻粕蛋白水解物中含有的人体必需氨基酸从营养均衡的角度来看，对人体的营养价值较高，可以作为食品添加剂应用于食品行业。

表8 不同种类蛋白质成分中必需氨基酸组成对比Table 8 Comparison of essential amino acid composition in different protein components

3 结论

吐温80的脱脂效果最好，脱脂率达到93.49%，脱脂后芝麻粕蛋白含量为（49.00±0.37）%，较未脱脂蛋白含量提高7.31%。碱性蛋白酶为水解芝麻粕蛋白的最佳蛋白酶，其最佳酶解条件为酶解温度50 ℃、酶解时间3.0 h、料水比1∶10（g∶mL）、加酶量0.04%，芝麻粕蛋白溶出率为88.94%。从脱脂后芝麻粕蛋白水解物中共检测到20种氨基酸，其中含有8种人体必需氨基酸的含量高于FAO/WHO的推荐值。