响应面法优化苦荞麦盐溶性球蛋白提取工艺研究

吴 颖，王 啸，邱树毅，马琳娜，郭佳佳

（贵州大学酿酒与食品工程学院贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550025）

荞麦有甜荞麦、金荞麦和苦荞麦三种[1]。苦荞麦（Fagopyrum tatarium）为廖科荞麦属、双子叶、一年生草本植物[2]，是一种药食同源植物。其丰富的蛋白质（8.51%～18.87%）[3]含量高于甜荞、小麦、水稻、高粱等[2]，且氨基酸种类多。苦荞蛋白根据溶解性不同可分为水溶清蛋白、盐溶球蛋白、醇溶蛋白、碱溶或者酸溶的谷蛋白[4]。苦荞蛋白具有调节血脂代谢[5-6]、抗氧化[7]、抑菌[8-9]、调节肠道菌群[4-5，10]等多种生物活性。目前，提取植物种子蛋白的方法主要有碱溶酸沉法、乙醇提取法、膜分离法、超声提取法、酶解酸沉法、离子交换法和Osborne法[11]。使用较多的是碱溶酸沉法，但加工过程中强碱易使蛋白理化性质改变，并且在提取过程中会消耗大量的酸碱等缺点[3]。有研究表明，荞麦蛋白降血压降胆固醇功能优于大豆蛋白[12]，李红梅等[13]通过研究苦荞麦四种蛋白成分体外抗氧化活性，清蛋白球蛋白均有体外抗氧化活性，其中球蛋白抗氧化活性最强。苦荞麦不同蛋白组分活性作用不同，苦荞球蛋白有较好的抗氧化性、抗疲劳[14]、降血脂[7]等活性作用。现阶段大部分都是对苦荞麦球蛋白的功能性质和生物活性进行研究，但是对球蛋白的提取工艺研究较少。苦荞麦球蛋白含有可应用于食品和医药的活性成分，在研究球蛋白活性作用和加工特性前，高效制备球蛋白具有重要意义。Osborne分级法提取蛋白操作简单、成本低。该研究以贵州威宁苦荞麦为研究对象，采用Osborne分级法提取苦荞麦球蛋白，利用响应面法优化苦荞麦球蛋白的提取工艺条件，高效制备球蛋白，为后面开展球蛋白活性研究打好基础，为苦荞麦球蛋白的综合开发利用提供材料来源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞麦：采摘于贵州省威宁县；体积分数85%的磷酸、氯化钠（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250（生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司；体积分数95%的乙醇、石油醚（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

Thermo CR3i冷冻型多功能离心机：美国赛默飞世尔科技公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：上海邦西仪器科技有限公司；SpectraMaxR190酶标仪：美谷分子仪器有限公司；FA2004N电子分析天平：上海菁海仪器有限公司；XTP-200G高速多功能粉碎机：浙江永康市红太阳机电有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将干燥的苦荞麦种子于多功能粉碎机中粉碎，过80目筛。在苦荞麦粉中以1∶5（g∶mL）的比例加入石油醚进行搅拌脱脂处理，脱脂期间数次更换石油醚[11，15-16]。将脱脂后的苦荞麦粉过滤收集，于通风橱中风干备用。

1.3.2 Osborne分级法提取苦荞麦球蛋白

称取5.00 g处理过的苦荞麦粉，在前期的研究基础上，采用最优工艺条件提取苦荞麦清蛋白。将提取清蛋白后的沉淀用氯化钠溶液在一定的盐含量、料液比、浸提温度、浸提时间的条件下进行搅拌浸提，再次以相同条件离心，上清液为球蛋白溶液，取上清液测定球蛋白含量。

1.3.3 测定方法

苦荞麦粗蛋白质含量：按照参考文献[17]的方法进行测定。

蛋白含量测定：采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量[1]，以吸光度值A为纵坐标（y），蛋白质量浓度（mg/L）为横坐标（x），绘制蛋白质标准曲线，建立回归方程：y=0.003 9x+0.006 2（R2=0.997 3）。

蛋白提取率计算公式[18]如下：

1.3.4 苦荞麦球蛋白提取单因素试验

提取完清蛋白的沉淀用氯化钠溶液搅拌浸提球蛋白，分别考察盐含量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、浸提温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、浸提时间（30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min）对球蛋白提取率的影响。

1.3.5 苦荞麦球蛋白提取工艺优化响应面试验

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

在单因素试验的基础上，应用响应面优化法中的Box-Behnken Design（BBD）试验设计法进行设计。以盐含量（A）、料液比（B）、浸提温度（C）和浸提时间（D）为考察因素，以球蛋白提取率（R）为响应值，进行4因素3水平的响应面分析试验，优化提取球蛋白的最佳工艺参数。每个试验组合重复测定2次，取其平均值作为结果，其因素与水平编码表见表1。

2 结果与分析

2.1 盐含量对苦荞麦球蛋白提取率的影响

图1 盐含量对苦荞麦球蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of salt content on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由图2可知，在一定盐含量范围内，随着盐含量的增加，蛋白提取率逐渐增加。当盐含量为1.0%时球蛋白提取率达到最大值3.81%，盐含量为1.2%时球蛋白提取率有所下降。可能是盐含量过大，盐与水分子作用加强，造成球蛋白溶解度降低[18]，或是蛋白质亚基之间相互作用造成影响，破坏了蛋白的稳定性，蛋白提取率下降[19]。因此，选择盐含量1.0%进行后续试验。

2.2 料液比对苦荞麦球蛋白提取率的影响

图2 料液比对苦荞麦球蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由图2可知，料液比增加，促进了球蛋白在盐溶液中的溶解，料液比为1∶15（g∶mL）时蛋白提取率达到最大值5.37%。随着料液比的继续增加，蛋白提取率开始下降，可能是体系中盐离子增加导致蛋白质变性，从而使球蛋白溶解度降低，提取率下降[20]。因此，选择料液比为1∶15（g∶mL）进行后续试验。

2.3 浸提温度对苦荞麦球蛋白提取率的影响

图3 浸提温度对苦荞麦球蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由图3可知，随着浸提温度的升高，蛋白提取率增大。在30～40 ℃之间蛋白提取率显著增加。可能是温度升高有助于蛋白质分子热运动，从而有更多蛋白质溶于水。在50～55 ℃之间蛋白提取率增加缓慢，浸提温度为55 ℃时，蛋白提取率达到最大值5.43%。蛋白质的糊化和变性温度是在60～80 ℃之间，浸提温度是50 ℃和55 ℃时蛋白提取率变化不大，但是温度过高，对蛋白稳定性有影响，且提取成本增加。因此，选择浸提温度55 ℃进行后续试验。

2.4 浸提时间对苦荞麦球蛋白提取率的影响

图4 浸提时间对苦荞麦球蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由图4可知，随着浸提时间增加，蛋白提取率增大，浸提时间是90 min时蛋白提取率达到最大值4.70%。90～105 min时蛋白提取率下降。主要是由于浸提时间达90 min时，蛋白溶出已达到饱和状态，搅拌时间过长，部分蛋白发生水解，蛋白提取率反而降低。因此选择浸提时间90 min进行后续试验。

2.5 响应面试验

2.5.1 响应面试验设计

根据提取苦荞麦球蛋白单因素试验结果，由Design-Expert 8.0.6软件设计出的试验方案及结果见表2。

表2 苦荞麦球蛋白提取条件优化响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface tests for extraction condition optimization of globulin from tartary buckwheat

2.5.2 回归方程及方差分析

通过表2的试验数据，采用Design-Expert 8.0.6软件进行拟合，得如下回归方程：R=5.72+0.30A-0.070B+0.33C+0.20D-0.42AB-0.047AC-0.027AD-0.66BC+0.013BD-0.26CD-0.64A2-0.70B2-0.54C2-0.57D2

对于上述回归模型进行方差分析，并对模型系数进行显著性检验，结果如表3。F值来检验各变量对响应值影响的显著性的高低，P越小，则相应变量的显著程度越高，而失拟项P＞0.05不显著。由表3方差分析结果可知，模型F=71.26，P＜0.000 1表明差异极显著，并且失拟项P=0.564 9＞0.05，说明该模型显著。模型决定系数R2=0.986 2，说明拟合程度很好，且调整决定系数R2adj=0.972 3，预测决定系数R2pre=0.937 3，方差相差很小，说明可信度高，可以用此模型来分析和预测蛋白提取率最优提取工艺。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，盐含量、料液比、温度和时间对蛋白提取率影响均显著（P＜0.05）；各因素对蛋白提取率影响程度为C＞A＞D＞B。对于交互作用来说，盐含量和料液比、料液比和温度以及温度和时间交互作用对球蛋白提取率的影响显著（P＜0.05），盐含量和温度、盐含量和时间以及料液比和时间交互作用对球蛋白提取率的影响不显著（P＞0.05），对于模型的二次项来说均极显著。

2.5.3 响应面结果分析

响应面图可以更加直观形象的反映出各单因素以及各单因素之间交互影响的强弱关系。响应面中，固定某个因素，改变另一个因素引起响应值变化，如果响应面走势较陡，说明该因素对响应值影响显著，反之则不显著。响应面优化模型因素（盐含量、料液比、浸提温度和浸提时间）交互作用对球蛋白提取率影响的响应面图和等高线图如图5。

由图5分析可知，盐含量和料液比交互作用对蛋白提取率影响的等高线图为椭圆形，说明盐含量和料液比交互作用对蛋白提取率影响显著。当料液比不变时，随着盐含量的增加，蛋白提取率呈现先上升后下降的趋势。同样，当盐含量不变时，随着料液比增加，蛋白提取率也呈现先增加后减小的趋势，且变化较为明显。当盐含量为1.05%，料液比为1∶14（g∶mL）左右时蛋白提取率达到最大值。

盐含量和浸提温度以及盐含量和浸提时间交互作用对蛋白提取率的影响的等高线图都接近圆形，说明对结果的影响不显著。虽然影响不显著，但当固定一个变量，蛋白提取率会随着另一个变量的增大先上升后下降，但是变化不是很大。当盐含量为1.05%，浸提温度为51 ℃，浸提时间为90 min附近达到最大值。

图5 盐含量、料液比、浸提温度、浸提时间交互作用对苦荞麦球蛋白提取率影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between salt content,material-liquid ratio,extraction temperature and time on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

料液比和浸提温度对蛋白提取率影响的等高线图为椭圆形，说明对结果的影响较为显著。当料液比不变时，随着浸提温度的增加，蛋白提取率呈现明显上升的趋势。但是当浸提温度不变时，随着料液比增加，蛋白提取率先迅速增加，然后出现少量的减小，且变化较为明显。在浸提温度为53 ℃，料液比为1∶13（g∶mL）附近达到最大值。

料液比和浸提时间交互作用对蛋白提取率的影响的等高线图近似圆形，说明对结果的影响不显著。随着因素的变化，蛋白提取率变化趋势为抛物面，在料液比1∶15（g∶mL），浸提时间为90 min取得最大值。

浸提温度和浸提时间交互作用对蛋白提取率的影响，等高线图为较扁的椭圆形，说明对蛋白提取率的影响较为显著。随着因素的增加，蛋白提取率先增加，在浸提温度为51 ℃，浸提时间为90 min左右达到最大值，然后蛋白提取率出现小量下降，且随着因素的变化，结果变化明显。

响应面图均为开口向下的凸面，故响应值R存在极大值，为进一步优化结果，根据Design-Expert软件得出在盐含量、料液比、浸提温度和浸提时间交互影响下，最优提取工艺为：盐含量为1.07%，料液比为1∶12.73（g∶mL），浸提温度为52.54 ℃，浸提时间为89.50 min，在此条件下模型预测的蛋白提取率为5.87%。

2.5.4 验证试验

据所建立的数学模型进行参数最优分析，得到最佳预测工艺条件为：盐含量为1.07%，料液比为1∶12.73（g∶mL），浸提温度为52.54 ℃，浸提时间为89.50 min，在此条件下模型预测的蛋白提取率为5.87%。考虑实际操作，修改条件为盐含量1.00%、料液比1∶13（g∶mL）、浸提温度为50 ℃、浸提时间为90 min，在此条件下，得出蛋白提取率为5.60%，与预测值5.87%接近，说明该模型能较好地预测实际蛋白提取率。

3 结论

本研究结果表明，在单因素试验基础上，采用4因素3水平的响应面分析方法，以盐含量、料液比、搅拌时间、搅拌温度为试验因素，以球蛋白提取率为响应值，试验中苦荞麦盐溶性球蛋白的最佳提取工艺条件为盐含量1.00%、料液比1∶13（g∶mL），浸提时间90 min，浸提温度50 ℃，在此条件下蛋白提取率为5.60%。苦荞麦蛋白是调节人体生理功能的良好食品，食品界与医药界都有相关研究，且日益受到人们的关注。本研究结果为解决苦荞麦在食品和医药界的应用提供思路，为高效制备苦荞麦球蛋白提供依据。