葛根素对去卵巢大鼠骨质疏松性骨折骨痂血管形成的影响

鲍根强 肖春来 张国辉 李华 赵晓亮 王泉

哈励逊国际和平医院手足外科，河北 衡水 053000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少，骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨微结构退化，骨脆性增加为主的一种全身性系统性疾病，骨折风险增高，骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是OP最严重的并发症，严重威胁老年人群的健康和生活质量[1]。骨质量下降导致骨质疏松，使得骨折愈合的组织学基础变差，骨折愈合延迟[2]。因此，OPF的防治和治疗已成为医学研究的重点之一。中草药治疗OP历史悠久，具备疗效显著、价格低、不良反应少等优点，研究发现葛根素可用于临床OP的预防和治疗，可促进去卵巢大鼠骨折愈合[3]。本研究主要探讨葛根素对OPF骨痂血管形成及骨折愈合的影响，为OPF治疗提供临床应用理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

60只SPF级健康雌性SD大鼠，3月龄，体重(320±30)g，订购于北京中国医学科学院实验动物研究所(合格证号SCXK 京2017-002)。葛根素注射液(100 mg/支，陕西安康制药厂，100 mg/支，批号：1610053)，柜式X线照片机购置于美国Hologic公司，ELISA检测试剂盒订购于武汉云克隆科技股份有限公司，兔抗鼠VEGF和BMP-2多克隆抗体均购于武汉博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1实验分组及药物干预：60只SPF级健康SD大鼠，于华北理工大学医学动物实验中心SPF级屏障环境伺养；实验随机分为假手术组、去势组、葛根素组，假手术组仅切除部分脂肪组织，去势组、葛根素组均行双侧卵巢切除术。4周后确认骨质疏松造模成功后，各组均行左侧股骨干闭合性骨折髓内固定术，于造模成功后第2天给予不同药物干预，假手术组、去势组：皮下注射0.9% Nacl 5 mL/kg，1次/d；葛根素组：皮下注射葛根素35 mg/kg，1次/d。连续用药6周。各组大鼠分笼饲养。

1.2.2构建去卵巢大鼠骨质疏松骨折模型：参照罗静华等[4]构建去卵巢大鼠骨质疏松性骨折模型的建立与内固定方法，术后常规青霉素80万U肌肉注射，预防感染。造模成功后于术后第2 天给予各组不同药物干预。

1.2.3组织标本处理：摄片后急性大失血法处死大鼠，左心室采血3～5 mL，离心，收取血清1～2 mL，-20 ℃保存备用。剥离取出右股骨骨痂组织，10%甲醛固定24 h，10%硝酸脱钙6周，制作组织切片，室温保存备用。

1.2.4放射性(X线)检查：术后6周进行X线摄片，观察各组大鼠骨折端骨痂生长和骨折线模糊情况。每组选取20只大鼠，放射学评估采用Warden等[5]的X线评分系统进行评估，依据骨折断端表现行骨折愈合评分，评分标准：没有愈合：1分；骨痂形成不明显：2分；骨折部分愈合：3分；骨折线逐渐消失，骨痂逐渐吸收消失：4分；完全愈合：5分。

1.2.5ELISA法检测血清浓度：采用ELISA试剂盒检测血清BMP-2和VEGF浓度，参照试剂盒说明书步骤进行操作，以450 nm波长测量各组的吸光度值(OD值)。

1.2.6HE染色：参照HE染色法实验步骤进行操作[6]，光镜下观察染色并采集图片。选取5个视野，计数新生毛细血管数，取其平均值。

1.2.7免疫组织化学染色法：参照免疫组织化学染色法步骤进行操作[7]。Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行半定量分析，免疫组织化学染色结果采用免疫反应评分(IRS)进行测定。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 骨折愈合观察及评分

假手术组骨折端骨折线几乎模糊或消失，骨痂大量生长，体积较大，骨痂连接包饶骨折断端周围及骨皮质，连接紧密，并开始重建塑形，断端髓腔再通；去势组骨断端骨折线依然清晰可见，骨痂未见明显生长，断端骨痂未连接，骨折愈合欠佳；葛根素组骨折线部分模糊或消失，较多骨痂生长，骨折端有骨痂包绕连接，部分愈合。去势组较假手术组骨折愈合评分显著降低(P<0.05)，葛根素组较去势组骨折愈合评分显著降低(P<0.05)。见图1和表1。

图1 X线观察骨折愈合情况 A：假手术组；B：去势组；C：葛根素组。Fig.1 X-ray observation of fracture healing. A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

表1 各组大鼠骨折愈合评分比较Table 1 Comparison of fracture healing scores among rats in each group

2.2 血清BMP-2和VEGF浓度

去势组较假手术组血清BMP-2和VEGF浓度均显著降低(P<0.05)，葛根素组较去势组血清BMP-2和VEGF浓度均显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清BMP-2和VEGF浓度比较Table 2 Comparison of serum BMP-2 and VEGF concentrations among the groups

2.3 骨痂组织学观察

假手术组骨痂组织可见大量骨小梁生长旺盛，排列致密有序，互相交错网状，大量成骨细胞及新生小血管等成熟骨组织；去势组骨痂组织可见少量骨小梁，生长稀疏，排列紊乱，大量纤维软骨细胞等纤维组织，成骨细胞及新生小血管少见；葛根素组骨痂组织可见较多骨小梁，骨小梁生长较旺盛，排列有序，可见较多成熟的骨细胞，新生小血管较多。去势组血管数显著低于假手术组(P<0.05)，葛根素组血管数显著高于去势组(P<0.05)。见图2和表3。

图2 观察骨痂组织形态结构变化(×200) A：假手术组；B：去势组；C：葛根素组。Fig.2 Observation of the morphological changes of the epiphysis (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

表3 各组大鼠骨痂组织血管计数比较Table 3 Comparison of blood vessel counts of osteophytes among each group

2.4 骨痂BMP-2和VECF表达

BMP-2定位于成骨细胞胞浆及骨小梁的边缘，VEGF定位于成骨细胞胞质及少量成熟软骨细胞，阳性反应呈棕黄色。去势组较假手术组BMP-2和VEGF阳性表达均显著降低(P<0.05)，葛根素组较去势组BMP-2和VEGF阳性表达均显著增高(P<0.05)。见图3、图4和表4。

图3 观察骨痂组织BMP-2表达(×200) A：假手术组；B：去势组；C：葛根素组。Fig.3 Observation of the expression of BMP-2 in osteophyte (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

图4 观察骨痂组织VEGF表达(×200) A：假手术组；B：去势组；C：葛根素组。Fig.4 Observation of the expressions of VEGF in osteophytes (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

表4 各组大鼠骨痂组织BMP-2和VECF表达比较Table 4 Comparison of expressions of BMP-2 and VEGF in osteophytes among rats in each group

3 讨论

OP是中老年人的常见病、多发病，严重危害老年人的健康[8]。OPF作为OP最严重的并发症，因其治疗较正常骨折困难，且易于发生二次骨折，是临床骨科的一大难题[9]。随着我国人口的老龄化的加剧，OP和OPF的发病率逐渐上升，给家庭和社会带来了沉重负担。

妇女绝经后体内雌激素水平下降是引起绝经后骨质疏松症的主要原因，雌激素代替疗法(ERT)可预防治疗OP[10]。雌激素可促进骨小梁生成和加速骨折的愈合，但是长期应用雌激素却能带来很多不良反应(如子宫内膜癌、血栓栓塞性疾病)[11]。葛根素是一种异黄酮衍生物，属于植物雌激素，其结构类似雌二醇，具有某些雌激素样作用，目前已经被广泛应用于治疗心脑血管疾病等[12]。葛根素通过与雌激素受体(ER)结合能增强成骨细胞的增殖与分化，促进成骨细胞的矿化功能，增加骨密度和骨强度，具有抗骨吸收、促进骨形成[13-15]。同时有研究表明也葛根素可以调节去卵巢大鼠OPF骨代谢，促进骨形成，加快骨折愈合[16]。

血管生成在骨发育、骨折愈合中起着重要作用。血管生成能提供骨愈合所需要的营养及各种成骨细胞成分，新生血管系统在骨发育、重塑、骨折修复和稳态中起着至关重要的作用，血管内皮细胞生长因子(VEGF)目前作为最重要的促血管生长因子，能促进内皮细胞的增殖和血管生成[17]。VEGF在血管内皮细胞增殖、迁移、渗透等方面起着重要调节作用，其诱导血管生成可促进骨再生与修复[18]。骨形态发生蛋白(BMPs)是最强有力的骨诱导剂，BMP能诱导间充质细胞分化为成软骨细胞和成骨细胞，促进新骨形成，其中尤以BMP-2作用最显著，BMP-2通过一系列级联反应激活其下游信号分子促进成骨细胞分化和诱导成骨的能力。

本研究表明去势组较假手术组骨折愈合评分、血清BMP-2和VEGF浓度、骨痂BMP-2和VEGF表达、微血管数均显著降低(P<0.05)，葛根素组较去势组上述指标均显著增高(P<0.05)。去势组骨痂组织可见少量骨小梁，生长稀疏，排列紊乱，间隙增宽，大量纤维软骨细胞等纤维组织，成骨细胞及新生小血管少见；葛根素组骨痂组织为大量成熟骨组织，骨小梁生长旺盛，互相交错网状，排列致密有序，较多成骨细胞，新生小血管较多。说明葛根素通过促进去卵巢大鼠OPF骨痂组织BMP-2和VEGF表达，促进骨痂血管形成，进而加快骨折愈合。周雪明等[19]研究发现葛根素能改善骨折后的骨和骨骼肌的血流量。田发明等[20]研究发现仙灵骨葆可促进去卵巢大鼠OPF血管形成，促进骨折早期愈合。

综上所述，葛根素通过介导去卵巢大鼠OPF骨痂BMP-2和VEGF表达，促进骨痂血管形成，改善骨组织形态学，加快骨折愈合。当然本实验研究仅是初步结果，但其具体作用机制目前尚未完全清楚，还有待于进一步研究。因此，探讨中西结合防治OP是未来研究的重点，同时也为中草药的应用开辟了新的途径。