实时荧光定量 PCR检测斑点热立克次体方法的建立

罗婉蓉，刘伯玉，陈 振，任翠平，高 越，杨 莉，朱 禹，余东阳，柳 燕

斑点热是一种由斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsiae，SFGR)感染引起、经蜱虫叮咬传播的人畜共患疾病。目前国际上已证明有19种SFGR对人类有致病性[1]。国内已鉴定的SFGR有5种：R.heilongjiangiensis、CandidatusR.tarasevichiae[2-7]。斑点热的临床表现为发热、皮疹、头痛、局部淋巴结肿大等[1]。病程早期缺乏特异性临床症状，患者往往因为误诊而延误病情，严重时可致死亡[8]。若患者能在早期得到快速准确的诊断，并给予抗菌药物则可以被治愈，减少死亡率。目前，斑点热的实验室诊断技术包括常用但缺乏特异性、敏感性的血清学检测和分子生物学检测。其中巢式PCR与常规PCR比较具有更高的特异性[9-10]，但操作相对繁琐。分离培养斑点热立克次体是确诊最直接、最可靠的依据[11]，但是耗时且有一定技术要求，难以在一般实验室开展。因此，建立快速检测立克次体感染的方法就显得尤为重要。

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技术是一种敏感特异的核酸检测方法，可用于病毒、细菌的快速检测[12]。该研究运用qPCR技术，根据SFGR外膜蛋白A基因(outer membrane protein A，ompA)建立SFGR的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象日本斑点热立克次体(R.janponicaAnhui 120 strain，本实验室分离培养并保存菌种)；其他立克次体属病原体(斑疹伤寒立克次体、恙虫病东方体、无形体)DNA以及常见非立克次体病原菌(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、支原体、螺旋体)DNA。

1.2 试剂及仪器PCR仪(德国Biometra公司)；实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；琼脂糖凝胶成像仪器(上海勤翔科学仪器有限公司)；Nanodrop2000分光光度计(美国ThermoFisher公司)。DNeasy Blood &Tissue Kit(德国QIAGEN公司)；pMD18-T Vector Cloning Kit、Gel DNA Extraction Kit、PremixTaq、PremixExTaq、DL2000 DNA Marker(日本TaKaRa公司)，琼脂糖凝胶(西班牙BIOWEST公司)，Plasmid Miniprep Kit(美国AXYGEN公司)。引物和探针由通用生物系统(安徽合肥)有限公司合成。

1.3 引物和探针的设计与合成参考GenBank中Rickettsiajaponicastrain Anhui 120ompA基因序列(序列号：KY484160.1)以及R.heilongjiangiensis054 ompA基因序列(序列号：AF179362.2)、R.raoultiistrain Khabarovsk ompA基因序列(序列号：AH015610.2)，利用Beacon Designer引物设计软件设计斑点热立克次体ompA基因特异性引物和探针(表1)。将设计好的引物和探针在NCBI官网上进行Primer-BLAST分析，验证该对引物和探针的特异性。

1.4 阳性标准品的构建用DNeasy Blood&Tissue Kit提取日本斑点热立克次体(Anhui120株)培养物核酸。使用本实验常规使用的两对巢式PCR引物(表1)扩增斑点热立克次体ompA基因。一轮PCR反应体系25 μl：2×PremixTaq反应液12.5 μl，上、下游引物(ompA-70F、ompA-701R)各0.7 μl，模板5 μl，去离子水补足体系。二轮PCR反应体系25 μl：2×PremixTaq反应液12.5 μl，上、下游引物(ompA-180F、ompA-602R)各0.7μl，模板1 μl，去离子水补足体系。相同的PCR反应条件参数设置：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，39个循环；72 ℃延伸10 min。配制1.2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳鉴定，切胶回收目的条带。按照pMD18-T Vector Cloning Kit说明书将ompA基因片段克隆到T载体上，并转化到DH5α大肠杆菌中。通过蓝白斑筛选以及菌落PCR(表1)鉴定，筛选出含阳性重组质粒菌液后收集菌液标本进行基因测序。将测序结果进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒可作为qPCR的阳性标准品。大量培养含重组质粒的细菌提取重组质粒，Nanodrop2000分光光度计测量DNA浓度，计算拷贝数。将制备好的标准品分装后置于-80 ℃冰箱冻存备用。

表1 PCR引物序列

1.5 反应条件的优化及标准曲线的建立按照PremixExTaq(Probe qPCR)试剂盒说明书配制20 μl的qPCR反应体系，引物浓度0.1、0.2、0.4 μmol/L，探针浓度0.4、0.5、0.6 μmol/L进行TaqManqPCR反应，对反应条件进行优化。分别以质粒含量为1.9×108、1.9×107、1.9×106、1.9×105、1.9×104、1.9×103、1.9×102、1.9×101和1.9×100拷贝作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始浓度的常用对数为横坐标，以循环阀值纵坐标，推导出标准曲线。

1.6 特异性检测用优化后的TaqManqPCR条件分别对SFGR(日本斑点热立克次体)、立克次体科其他常见病原体(斑疹伤寒立克次体、恙虫病东方体、无形体)、常见非立克次体病原菌 (大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、螺旋体、支原体)DNA进行qPCR检测。

1.7 敏感性试验分别对质粒含量为1.9×103、1.9×102、1.9×101、1.9×100和1.9×10-1拷贝的标准品进行检测，以优化后的条件进行TaqMan qPCR检测，明确建立方法的最低检测限。

1.8 重复性试验用建立的TaqMan qPCR方法分别对质粒含量为1.9×106、1.9×105、1.9×104、1.9×103和1.9×102拷贝的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算变异系数。再以相同标准质粒为模板，在不同时间段进行3次独立重复试验，以分析组间差异。

1.9 临床样品检测对来自临床采集的80份不明原因发热患者的血标本进行核酸提取。用建立的TaqMan qPCR检测方法和巢式PCR方法同时对该临床患者血标本核酸进行检测，计算2种检测方法之间的符合率。

1.10 统计学处理质粒构建及测序结果分析采用Lasergene 7.0软件。分别用SPSS 20.0 及GraphPad Prism 5.0 软件进行描述性统计分析和作图。两种PCR方法阳性率比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒的构建ompA基因经巢式PCR扩增后，目的条带大小为455 bp。将目的条带插入到T载体中构建重组质粒并测序验证。见图1。

图1 插入R.janponica(Anhui120株)ompA基因重组质粒的构建与鉴定

2.2 TaqManqPCR标准曲线优化后的TaqMan qPCR最佳反应体系是：PremixExTaq(Probe qPCR)10 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，探针(10 μmol/L)1.0 μl，模板2 μl，灭菌去离子水补足至20 μl体系。以各标准品中质粒浓度的常用对数值为横坐标，以循环阀值为纵坐标，获得ompAqPCR标准曲线：Y=-3.220X+33.162，相关系数为0.996，扩增效率为104.6%，表明建立的TaqMan qPCR方法具有良好的线性关系，见图2。

图2 ompA基因TaqMan qPCR标准曲线

2.3 TaqMan qPCR的特异性分析建立的qPCR方法仅对斑点热立克次体ompA有阳性扩增信号，其他常见病原体包括普氏立克次体、恙虫病东方体、无形体、埃里克体、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均为阴性，表明建立的TaqMan qPCR方法特异性强，见图3。

图3 ompA基因TaqMan qPCR特异性结果

2.4 TaqMan qPCR的灵敏性分析建立的qPCR方法对质粒含量为1.9×103、1.9×102、1.9×101、1.9×100和1.9×10-1拷贝有阳性扩增信号，对1.9×100、1.9×10-1拷贝均未检测到扩增信号，表明本研究建立的方法的最低检测限为19拷贝。见图4。

图4 ompA基因TaqMan qPCR敏感性结果 1～5：标准品质粒浓度为1.9×103、1.9×102、1.9×101、1.9×100和1.9×10-1拷贝

2.5 TaqMan qPCR的重复性分析建立的TaqManqPCR 检测质粒含量为1.9×106、1.9×105、1.9×104、1.9×103和1.9×102拷贝标准品的组间变异系数为0.56%～1.47%，组间变异系数为1.01%～2.29%，见表2。

表2 TaqMan 探针qPCR重复性试验结果

2.6 TaqMan qPCR方法对临床样品检测普通PCR阳性的样品经TaqMan qPCR的检测方法检测均为阳性，两种检测方法的一致率为91.25%。2种检测方法比较差异有统计学意义(χ2=5.14，P<0.05)。

表明对80份临床病人标本核酸进行检测TaqManqPCR方法较巢式PCR敏感性更高。见表3。

表3 两种PCR方法对临床样品的检测结果

3 讨论

国内的斑点热立克次体流行病学调查开始于1958年。长期的研究调查显示斑点热立克次体分布较广，至今已有十几个省市、自治县证实存在斑点热立克次体感染，从患者、蜱、蜱虫卵以及啮齿动物体内共分离出20余株SFGR，流行病学调查显示人群对该群病原体普遍易感[7, 13]。目前根据SFGR 17 ku抗原、gltA、geneD、ompA基因，已经建立了多种PCR鉴定方法[14]。其中ompA作为斑点热立克次体细胞膜表面蛋白，在立克次体的感染与免疫中发挥重要作用，如介导立克次体黏附和入侵宿主细胞、促进立克次体在细胞内生长繁殖以及诱导机体的免疫应答等[15]。

Regnery et al[16]根据立氏立克次体ompA基因设计的一对引物Rr190.70p(5-ATGGCGAAT ATTTCTCCAAAA-3′)和Rr190.602n(5′-AGTGCAG CATTCGCTCCCCCT-3′)，其扩增序列结合限制性内切酶片段长度多态性图谱法(PCR/RFLP)被广泛应用于斑点热立克次体新种的鉴定。此方法能区别具有高度遗传同源性的SFGR，在于这对引物扩增的目的片段既有SFGR的保守序列，又具有SFGR不同种之间特殊酶切位点，可以通过不同的限制性内切酶消化区别SFGR不同的种。本实验通过巢式PCR(两对引物ompA-70F和ompA-701R、ompA-180F和ompA-602R)扩增出SFGR的保守序列，再根据这段保守序列设计特异性的引物和探针，建立检测斑点热立克次体的TaqMan qPCR方法。

评估建立的qPCR方法的3项重要指标包括：特异性、敏感性和重复性。本实验在进行特异性分析时，选择斑疹伤寒立克次体、恙虫病东方体、无形体，以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、螺旋体、支原体这7种病原体DNA与SFGR DNA同时进行TaqMan qPCR检测。前3种与SFGR属于立克次体科下的不同种属，后四种为临床较为常见的病原体。结果显示SFGR核酸扩增有阳性信号，而其他7种均为阴性结果，显示该方法具有较好的种属特异性。对重组质粒标准品进行10倍梯度稀释检测，最低可检测出19拷贝，表明该方法具有良好的检测灵敏度。对同一批次标准品进行组内和组间重复性分析时，两者变异系数均低(最高仅为1.47%和2.29%)，结合构建重组质粒作为试验的标准品可大量获取以及长期保存的特点，可以有效保障后续开发标准化诊断试剂盒标准品的一致性。将建立的TaqMan qPCR方法与巢式PCR同时对临床患者样本进行检测，巢式PCR检测有1份阳性，阳性率为1.25%，荧光定量PCR检测有8份阳性，阳性率为10.00%，巢式PCR检测阳性标本用荧光定量PCR检测为阳性，一致率为91.25%。两种方法比较差异有统计学意义(P<0.05)，且荧光定量PCR检测的灵敏度高于巢式PCR在检测较低立克次体含量样本时有一定的应用价值。荧光定量PCR反应时间短，一般45 min～1 h就能完成反应有利于结果的快速输出。因此本实验建立的检测斑点热立克次体TaqMan qPCR方法可应用于实验室对疑似斑点热患者样本的快速诊断。