浓度对髓鞘碱性蛋白与髓磷脂分子间相互作用的影响研究

张 蕾,丁 琦,王小梅

(西安航空学院 理学院，西安 710077)

0 引言

髓鞘是有规则、分节段地包裹在神经轴突周围的一种神经胶质细胞的多层细胞膜结构，对轴突除了具有绝缘保护作用外，还能提高神经冲动的传导速度[1-2]。髓鞘碱性蛋白(MBP，相对分子质量为18.5 KDa)位于髓鞘浆膜面上，维持着中枢神经系统髓鞘结构和功能的稳定，具有神经组织的特异性。当脑外伤害引起神经组织细胞的破坏时，MBP就会进入脑脊液；少部分随受损的血脑屏障进入血液，此时MBP会明显增加，导致中枢神经系统被破坏，出现与脑损伤相关的疾病。因此，检测脑脊液和血液中MBP的含量，是反应神经组织细胞有无实质性损伤的一个灵敏而可靠的指标[3-6]。

MBP是中枢神经系统(CNS)成熟髓鞘中的主要蛋白，且是MBP家族在进化过程中最保守的蛋白。据报道，脊椎动物中的MBP含有170个氨基酸残基，在蛋白质的结构和功能中起着关键作用[7-8]。MBP与髓鞘膜中具有不同极性头部基团的磷脂分子相互作用，会促进少突胶质细胞的融合，形成多层膜结构的主要致密线。MBP吸附到髓鞘脂膜上可以维持髓鞘结构的紧密性和功能的稳定性[9-11]。

本文主要研究不同浓度的MBP分别与髓磷脂POPC、POPE、POPS分子发生相互作用而形成的仿生膜的构象变化和物理特性。使用Langmuir-Blodgett(LB)技术研究了MBP对髓磷脂膜吸附的压缩-扩张循环曲线，并利用表面损失量分析了混合单层膜的稳定性。用原子力显微镜(AFM)分别观察了MBP对髓磷脂POPC、POPE和POPS单层膜的表面形貌的影响。本文的研究结论对探讨相关疾病的发病机理和治疗具有一定的指导意义。

1 实验材料和方法

1.1 实验试剂

从牛脑中分离制备实验所用到的MBP，并按照Deibler等人的方法在水溶性溶液中纯化[12]。高纯度(至少99%)的1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱(POPC，分子量为760.1 g/mol)，1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(钠盐)(POPE，分子量为718.0 g/mol)，1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(POPS，分子量为784.0 g/mol)购买于Avanti Polar Lipids Inc公司，无需进一步纯化。实验中使用的亚相为10 mM Tris-HCL 缓冲液，并将pH值调节至7.2。将脂质粉末溶解在氯仿/甲醇(3：1，v / v)混合液中，配制最终浓度为1 mg/mL的脂质储备液。实验用去离子水由超纯水系统制备，其电阻率高于18.2 MΩcm。

1.2 连续压缩-扩张循环曲线测定

使用KSV-Minitrough(KSV公司，芬兰)膜天平测定了混合单层膜在空气/亚相界面上的连续压缩-扩张循环曲线， LB 子的有效面积为273 cm2，容积为240 mL。每次实验前，先后用无水乙醇溶液和超纯水彻底清洗LB槽和滑障。使用微量进样器将适量的脂质溶液滴加到含有一定浓度MBP的亚相界面上，静待15 min，直至有机溶剂完全挥发，表面压力趋于稳定。以10 mm/min的速率对单层膜进行压缩，得到表面压力(π)随平均分子面积(A)变化等温线。

测定压缩-扩张循环曲线：设定目标膜压为30mN/m，计算机自动采集混合单层膜的压缩-扩张循环曲线。每组数据至少重复三次，以检验数据的可重复性。所有实验温度控制在(22±1)℃。

1.3 原子力显微镜观测

利用原子力显微镜(WET-SPM-9500-J3，日本岛津)对转移至云母基底上的混合单分膜的表面形貌进行表征。AFM微悬臂的弹性常数为0.06 N/m，探针材料为Si3N4，扫描频率为1Hz，采集像素为512×512。整个AFM观测过程均在室温下进行。

2 结果与讨论

2.1 连续压缩-扩张循环曲线表面损失百分比的定量分析

“滞回”现象是由于压缩-扩张引起的单层构象变化而导致的连续压缩和扩张曲线遵循的不同途径，该“滞回”现象可用表面损失百分比(Apparent loss(%))进行量化分析[13]：

式中， Ac1表示单层膜第一次压缩时曲线在固定表面压力下的平均分子面积， Aci中,i = 1、2、3分别表示循环中第一、第二和第三次压缩至相同表面压力下的平均分子面积。

2.2 空气/亚相界面MBP与POPC、POPE和POPS分子间相互作用的“滞回”曲线分析

图1给出了浓度为1.0、2.5、4.0 和5.5 nM的MBP分别吸附到POPC(图a)、POPE(图b)和POPS(图c)单分子层上，表面压在0-30mN/m之间的连续压缩-扩张循环曲线。不同浓度的MBP吸附到同一个脂质单层膜所呈现出来的压缩-扩张循环曲线的形状基本相似，但随着MBP浓度的增大，曲线整体向分子面积增大的方向移动，这说明MBP被吸附到单层膜界面上。随着MBP浓度的增加，混合单层膜在0～30 mN/m时的压缩-扩张曲线不再重合，均出现“滞后”的现象，是由于相互作用分子在界面发生重排导致的。为了进一步研究MBP对POPC、POPE和POPS脂膜稳定性的影响，利用方程(1)计算了表面压力为10 mN/m时，混合单层膜的表面损失量。

(a)POPC+MBP

(b)POPE+MBP

(c)POPS+MBP

表1 给出了在10 mN/m的表面压力下，不同浓度的MBP (CMBP=1.0、2.5、4.0和5.5 nM)与不同脂质(POPC、POPE和POPS)相互作用的表面损失量。

表1 各混合单层膜的表面损失量

数据分析可得，各单层膜的表面损失量会因MBP浓度增加而上升，其中MBP/POPE混合单层膜的表面损失量相对较小，这说明MBP与POPE分子间的相互作用较强，MBP嵌入到POPE单层膜中，从而提高了单层膜的稳定性。对于MBP/POPC和MBP/POPS混合单层膜，压缩-扩张循环曲线的“滞后”现象比较明显，这是由于MBP/POPC和MBP/POPS结合物在压缩过程中被挤入亚相中，使得混合单层膜的表面损失量变大。然而，MBP/POPE和MBP/POPS混合单层膜在CMBP=4.0 nM和CMBP=5.5 nM时，表面损失量稍有减小，均在标准误差范围内。对于MBP/POPC脂膜在CMBP=1.0 nM 表面损失量为 6.2±1.3%，意味着在压缩过程中，POPC分子被挤入亚相，并在单层膜的下方，但由于分子间的相互作用力比较弱，当MBP的浓度为2.5 nM，MBP被吸附到界面上，使得表面损失量减小。当继续增大MBP浓度，相对分子质量较大的MBP携带POPC分子进入到单层膜下方，进一步导致表面损失量变大。

综上所述，表面损失量的参数值的大小表明，MBP/POPE混合单层膜最为稳定，其次为MBP/POPC混合单层膜，最后为MBP/POPS混合单层膜。

2.3 原子力显微镜观测

为了进一步探究MBP的浓度对混合单层膜影响的内在微观结构变化，采用AFM (接触模式)对混合单层膜的表面形貌进行了表征。当亚相中MBP的浓度为1 nM时，对POPC、POPE以及POPS单层膜影响的AFM图像如图2所示。

(a)POPC+MBP(0 nM)

(b)POPC+MBP(1 nM)

(c)POPE+MBP(0 nM)

(d)POPE+MBP(1 nM)

(e)POPS+MBP(0 nM)

(f)POPS+MBP(1 nM)

显然，MBP的加入对POPE单层膜的表面形貌影响不大， MBP/POPE混合单层膜表面分子排列较为紧密，单层膜较稳定，并且可以看到表面附有大量的MBP颗粒，这说明MBP嵌入到POPE单层膜上，增加了膜的稳定性； MBP/POPC脂膜表面出现“凹陷洞洞”状，说明相对分子大的MBP携带一部分POPC分子进入亚相，使得表面出现“孔洞”；MBP/POPS脂膜表面出现“树杈状”，表明POPS单分子层不稳定，很容易受到MBP的影响，因此出现“树杈状”的形貌图。总体而言，对于MBP/POPC和MBP/POPS混合单层膜的表面形貌，MBP的加入对脂膜表面形貌的影响比较大，并且脂膜表面变得稀疏，进而界面分子的损失量也随之增大，和前面分析结果一致。

3 结论

研究了不同浓度的MBP对不同磷脂POPC、POPE和POPS单分子层的影响。结果表明：(1)随着亚相中MBP浓度的增大，混合单层膜的压缩-扩张循环曲线均向平均分子面积增大的方向移动， 意味着MBP分子吸附到了单层膜的界面上。(2)连续压缩-扩张循环曲线的数据分析表明不同浓度MBP与不同磷脂分子之间相互作用时，表面损失量的大小排序为：MBP/POPE < MBP/POPC < MBP/POPS，说明MBP/POPE混合单层膜较为稳定，MBP对POPE单层膜界面分子的二维排列影响也较小，而MBP/POPS混合单层膜则不稳定，MBP对POPS单层膜界面分子的二维排列影响更加显著。(3)从AFM图像可以看出，MBP与不同的脂质分子间均会发生相互作用，并且MBP不但会嵌入到POPE单层膜，并在界面形成很多聚集体，还会引起POPC和POPS脂质单层膜的构象发生改变，相对分子较大的MBP分子会携带POPC和POPS分子进入亚相，导致界面分子排列疏松。

综上所述，根据连续压缩-扩张循环曲线来计算不同浓度的MBP与不同头部基团的不饱和髓磷脂相互作用的表面损失量，这对理解MBP维持髓鞘稳定性和紧密性提供了理论基础和实验依据。