CDC14B在小鼠1-细胞期受精卵各细胞周期的动态表达及其定位

刘岚清，李瑞林，周晓敏，孟 峻

( 1．内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古 呼和浩特 010059 ；2．内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010050 )

细胞分裂周期蛋白14B(cell division cycle 14B,CDC14B)广泛参与细胞减数分裂、有丝分裂、胞质分裂、中心体复制、维持纺锤体稳定性、G2期损伤检查点激活、DNA损伤修复、细胞癌变和纤毛形成等生理病理过程[1-2]。CDC14B是一种高度保守的双特异性磷酸酶，通过使靶蛋白的丝氨酸和苏氨酸去磷酸化，进而调节靶蛋白的生物学活性[3]。POWERS等[4]研究表明：在鼠卵母细胞发生减数分裂时，过表达的CDC14B可减慢卵母细胞减数分裂的恢复，甚至导致卵母细胞停止发育，而缺乏CDC14B的表达会促进减数分裂的恢复。研究[5-6]表明：CDC14B在MⅠ-MⅡ期定位在纺锤体，可通过调节E-钙黏蛋1(cadherin,CDH1)和降解细胞周期素B1(cyclin B1,CCNB1)的表达，减少CCNB1与细胞周期依赖性激酶CDK1的结合，对抗CDC2活性，从而阻滞鼠卵母细胞减数分裂的恢复，表明CDC14B可能是减数分裂的负性调控因子。对人骨肉瘤细胞系U2OS的研究[7]表明:CDC14B在间期定位于细胞核中，在后期聚集到纺锤体中央区，沉默CDC14B会引起染色体分离错误，多极纺锤轴的形成，表明CDC14B具有捆绑和稳定微管的功能。在对U2OS的研究[8]中发现：CDC14B通过激活细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)，激活DNA修复通路，修复损伤的DNA。另有学者[9-13]发现：下调人结肠癌细胞系HCT116中CDC14B的表达可导致细胞DNA修复能力缺陷，人类喉癌组织中CDC14B表达增强,宫颈癌中CDC14B基因的5-羟甲基胞嘧啶高于5-甲基胞嘧啶,特殊类型的甲状腺髓样癌中CDC14B明显失活。此外，还有研究者[14-15]发现：CDC14B突变的鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)会提前表现出衰老状态，DNA损伤情况较为严重，也表明CDC14B具有DNA损伤修复作用。以上研究充分说明CDC14B在细胞分裂过程中具有重要的生物学作用，有重要的研究价值。但关于小鼠1-细胞期受精卵中是否存在CDC14B及其在有丝裂分裂中的调控作用尚不清楚，其是否也定位于纺锤体进而调控纺锤体的功能，目前国内外尚未见报道。本研究以小鼠1-细胞期受精卵为研究对象，主要研究CDC14B在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中的表达和定位，为研究CDC14B在小鼠受精卵G2/M期转换中的作用机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器昆明系SPF级小鼠由内蒙古大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(蒙)2016-0001。雌鼠4～6周，体质量18～20 g；雄鼠8周龄以上，体质量25～30 g。fast200 RNA提取试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)，CDC14B抗体、β-Actin抗体和β微管蛋白(β-tubulin)抗体(美国Santa Cruz公司)，MB培养基(美国Invitrogen公司)，M16培养液、矿物油和透明质酸酶(美国Sigma公司)，孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素(hCG)(赤峰博恩药业有限公司),Hoechst33258和细胞裂解液(碧云天生物技术公司)，Alexa Fluor 594 标记的驴抗兔IgG(H+L)和Alexa Fluor 488 标记的驴抗山羊IgG(H+L)(美国Jackson Immuno Research公司)，ECL化学发光试剂盒(美国Piece Biotechnology 公司)，预染蛋白Marker(立陶宛MBI公司提供)，RNA PCR(AMV)ver3.0试剂盒(日本TaKaRa公司)，TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒(北京全式金公司)。35 mm和60 mm培养皿(丹麦Nunc公司)，高速微量冷冻离心机(5427R)和生物安全柜(1300系列Ⅱ级A2型)[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，万分之一电子天平(110S) (德国Sartorius公司 )，CO2培养箱(CB115) (德国WTB-binder公司)，纯水机(JCHRO-40Z)(北京捷创伟业环保设备公司)，恒温培养箱(江苏省宏华仪器厂)，涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造公司)，台式高速离心机(LG16-WA)(北京京立离心机有限公司)，实时荧光定量PCR仪和电泳槽0.75ram垂直板(美国Bio-Tad公司)，激光共聚焦扫描显微镜(德国Leica公司)，相差显微镜(日本奥林巴斯公司)，

1.2 小鼠受精卵的采集和培养4～6周的成熟雌性小鼠10只，在明暗交替、温度适宜的环境中喂养4～6 d。将腹腔注射当日作为第1天，于中午12:00每只雌性小鼠腹腔内注射孕马血清10 IU，于第3天中午12:00每只雌性小鼠腹腔内注射hCG 10 IU。在注射hCG后，将雄性小鼠和雌性小鼠合笼过夜。至次日早晨分别检查与雄鼠合笼过夜的每只雌性小鼠的阴栓，雌性小鼠有阴栓则表明已经成功交配。将雌性小鼠脱颈处死解剖，取出两侧卵巢，放入备有生理盐水滴的培养皿上，在体视显微镜下撕开输卵管壶腹部膨大处，流出受精卵细胞团，吸入溶有透明质酸酶 (0.3 g·L-1)的M2培养液中，清洗受精卵细胞团，去除颗粒细胞，再用M16培养液清洗2～3次，直到无颗粒细胞为止。清洗完成后，将G1期受精卵移入M16培养液中，覆盖一层矿物油，于CO2培养箱中培养，培养条件为37℃、5%CO2和饱和湿度。

不同细胞周期1-细胞期受精卵的收集主要根据受精卵细胞的形态和hCG注射后的时间，分别收集G1、S、G2和M期4个阶段的受精卵。G1期受精卵：在注射hCG后19～20 h收集G1期受精卵，此时卵细胞中雄雌原核的距离较远，雄原核较雌原核稍微大一些；S期受精卵：在注射hCG后23～24 h收集S期受精卵，此时雄雌原核的体积渐渐增大并靠近，核仁已经出现；G2期受精卵：在注射hCG后27～28 h收集G2期受精卵，此时雌雄原核的轮廓慢慢消失，胞浆呈粗大颗粒状，细胞膜边缘开始出现凹陷；M期受精卵：在注射hCG后30 h收集M期受精卵，此时出现胞质分裂，受精卵胞体拉长，染色体分散到两极。

1.3 RT-PCR法检测1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA表达水平将收集到的每组100个1-细胞期受精卵按 fast200试剂盒操作步骤提取RNA,用微量紫外分光光度计在波长280 nm和260 nm处测定2 μL所提 mRNA的吸光度(A)值，计算A(260)/A(280)的比值，若比值为1.8～2.0，说明纯度较高，所提取的mRNA可以进行反转录实验。采用RNA PCR(AMV)ver3.0试剂盒按操作步骤进行反转录，反应体系为10 μL。反 转 录 条 件：42℃、30 min，99℃、5 min，4℃、5 min，1个循环。采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒进行RT-PCR,PCR引物由日本TaKaRa公司设计，引物序列：CDC14B(NM_001122989.1)，5′-ATGACCTGTCCTTAAATGGGCTTG-3′和 5′-TTCAGGGCCCGAAGT-

CTGTC-3′；β-actin(NM_007393)，5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′和5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′。PCR反应体系为20 μL，反应条件: 94℃预变性30 s，94℃、 5 s，60℃、 15 s，45个循环；95℃、15 s，56℃、30 s，95℃、15 s，1个循环。采用2-ΔΔct法计算CDC14B mRNA表达水平。

1.4 Western blotting法检测1-细胞期受精卵中CDC14B蛋白表达水平分别收集G1、S、G2和M 期4个时期的小鼠1-细胞期受精卵各200个，从培养皿转移到1.5 mL Eppendof管中，4℃、3 000 r·min-1离心10 min，尽量去除培养液，加入适量缓冲液(20 mmol·L-1Tris-Hcl，pH 7.5，2 mmol·L-1EDTA，0.25 mmol·L-1Glucose，10 mmol·L-1EGTA)，充分振荡混匀，然后经3～4次冻融循环，使所有受精卵完全裂解，-20℃保存备用。加入适量SDS缓冲液，100℃煮沸5 min使蛋白变性，加入电泳液后开始准备上样，SDS-PAGE电泳分离。将蛋白转至硝酸纤维素膜上，将膜用TBS浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上封闭1 h。与CDC14B抗体(稀释比为1∶100)和β-actin抗体(稀释比为1∶500) 4℃孵育过夜，在室温下脱色摇床上洗涤3次。将HRP偶联的兔抗羊IgG或羊抗兔IgG用TBST溶液室温下孵育2 h，在室温下脱色摇床上洗涤3次，ECL化学发光法显影成像，以CDC14B条带的灰度值与β-actin条带的灰度值比值代表蛋白表达水平。

1.5 细胞免疫荧光法检测CDC14B和β-tubulin在小鼠1-细胞期受精卵中各期的亚细胞共定位将培养得到的G1、S、G2和M期受精卵分别用PBS(含1%BSA)洗涤3次，然后用4%多聚甲醛室温固定1 h， PBST溶液(PBS加入0.01%Tween20)洗涤3次，0.1%Triton X-100(溶解于PBS)打孔30 min。用含5%BSA的PBS封闭液封闭1 h，将上述处理好的受精卵转入一抗即CDC14B和β-tubulin抗体，与封闭液按1∶500稀释，室温2 h，洗液洗涤3次后将受精卵转入二抗(Alexa Fluor 594 标记的驴抗兔IgG和Alexa Fluor 488标记的驴抗山羊IgG,按1∶50稀释)中，孵育条件为室温、避光1 h，洗涤3次，再用Hoechst33258染色10 min，使核酸染色，在激光共聚焦扫描显微镜下观察CDC14B和β-tubulin在受精卵中的定位及核酸染色情况。

2 结 果

2.1 小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA表达水平RT-PCR结果显示：小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中均有CDC14B mRNA表达，G1、S、G2和M期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA表达水平分别为1.00±0.06、1.17±0.03、2.59±0.05和1.75±0.01，与G1期比较，S、G2和M期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01)。见图1。

*P<0.05，**P<0.01 compared with G1 phase.

2.2 小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中CDC14B蛋白表达水平Western blotting法检测结果显示：小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中均有CDC14B蛋白表达，其表达规律与其mRNA表达规律相符。CDC14B蛋白从G1期开始表达(0.50±0.02)，S期其表达水平 (0.57±0.03)升高，高表达持续到G2期(0.90±0.02)，M期CDC14B蛋白表达水平(0.71±0.05)降低。与G1期比较，S、G2和M期的1-细胞期受精卵中CDC14B蛋白表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01)。见图2。

Lane 1:G1 phase; Lane 2:S phase; Lane 3:G2 phase; Lane 4:M phase.*P<0.05，**P<0.01 compared with G1 phase.

2.3 CDC14B和β-tubulin在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中的共定位细胞免疫荧光实验结果显示：在小鼠1-细胞期受精卵中，CDC14B(红色荧光)和β-tubulin(绿色荧光)在G1期和S期共定位于小鼠受精卵皮质；在G2早期，CDC14B和β-tubulin共定位于细胞质；在G2晚期，部分CDC14B入核；在M期，CDC14B和β-tubulin共定位于纺锤体。见图3 (插页一)。

3 讨 论

1970年，HARTWELL通过对出芽酵母的研究首次发现CDC14，并将其定义为有丝分裂退出因子[16]。CDC14B作为一种丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，可使细胞周期依赖性激酶的多种底物去磷酸化，进而参与调节多种生理病理过程[17-20]，而CDC14B在小鼠受精卵早期发育过程中的表达及定位目前尚未见报道。本研究结果表明：小鼠G1、S、G2和M 4个时期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA 均有表达，在G2期其表达水平最高，至M期下降，且其蛋白表达规律与mRNA表达规律相符，G2/M期的过渡是细胞发育、生长和增殖的重要时期，与G1期比较，G2和M期1-细胞期受精卵中CDC14B的表达水平均明显升高，表明CDC14B可能调控小鼠1-细胞期受精卵G2/M期的转换。

蛋白定位与其功能密切联系，本实验通过细胞免疫荧光证实：在小鼠1-细胞期受精卵中，G1和S期CDC14B与β-tubulin共定位于受精卵皮质，G2期CDC14B与β-tubulin共定位于细胞质和细胞核，M期CDC14B与纺锤体共定位。在小鼠卵母细胞中，CDC14B与纺锤体共定位，可通过调节纺锤体的功能进而调节减数分裂。在本研究中，小鼠受精卵细胞与微管蛋白β-tubulin也共定位，表明CDC14B可能参与调控纺锤体的功能。CDC14B是一种重要的蛋白磷酸酶，具有广泛的研究前景，本课题组接下来的研究就是通过构建CDC14B的表达质粒，过表达或沉默CDC14B，观察过表达和敲减的CDC14B对小鼠受精卵生长发育的影响，探讨CDC14B在受精卵G2/M期转换中是否具有调控作用，再进一步研究CDC14B蛋白直接作用的相关靶蛋白，与靶蛋白的相互作用及具体作用位点，为癌症的诊断和治疗开辟一条新的途径。对具有天然细胞周期模型的小鼠受精卵的研究，将有利于揭示哺乳动物生殖发育的调控机制，更全面地认识细胞生长、发育、癌变和凋亡的内在机制，对动物繁殖、人类生殖辅助技术和肿瘤的靶向治疗具有重要的社会实用价值。