致伤口感染犬巴斯德菌耐药基因全基因测序分析

薛玉芹，黄 韵，张正银，王亚婷，金 英，桂 芸，余 彬

（上海市浦东新区浦南医院检验科，上海 200126 ）

犬巴斯德菌属于巴斯德菌属，广泛分布于健康或患病的动物中，常寄生于动物的鼻咽部和牙龈[1]。人类感染犬巴斯德菌主要与动物咬伤、挠伤等密切接触行为以及一些非创伤性的日常接触，如舔舐等有关。临床最常见的感染是狗咬伤所致伤口皮肤及软组织感染。犬巴斯德菌感染人类较为少见，但近些年随着宠物流行等原因，人类犬巴斯德菌感染病例呈上升趋势[2]。本研究分析1例因狗咬伤导致双足及右前臂皮肤撕裂伤感染患者的临床资料，并通过全基因测序的方法分析其携带的耐药基因，以期为临床治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 病例资料

患者女，30岁，因“狗咬伤致双足及右前臂疼痛伴皮肤撕裂伤2 d”于2018年8月3日门诊就诊。入院时可见多处皮肤裂伤，伴有局部肿胀，急诊予以犬伤处理原则处理伤口，并注射狂犬疫苗。3 d后双足肿痛，右前臂疼痛且活动受限，为进一步治疗收入院。入院查体：体温36.7 ℃，脉搏67次/min，呼吸20次/min，血压13.83/8.65 kPa（104/65 mmHg）。专科检查：双足可见多处皮肤裂伤，局部皮肤红肿，压痛（+），关节活动范围正常，皮肤感觉正常，双下肢肌力Ⅴ级，足背动脉可及；辅助检查：白细胞计数8.0×109/L，中性粒细胞百分比70%，C反应蛋白42 mg/L，红细胞沉降率40 mm/h。8月7日右足肿胀明显，有脓液渗出，挤压后脓液量增多，采集脓液样本送细菌培养，当日行清创负压封闭引流术，经验给予头孢呋辛钠抗感染治疗。8月12日拆除引流管，拆除后见左足伤口新鲜肉芽组织生长，右足原伤口处仍有较多渗出，考虑感染控制不佳。

1.2 方法

按《全国临床检验操作规程》（第4版）的操作方法，将右足伤口脓液分别接种于哥伦比亚血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯琼脂平板（上海科马嘉公司），35 ℃、5%CO2环境中培养24 h。培养出的可疑菌株采用VITEK 2-Compact全自动微生物分析鉴定系统及配套鉴定卡（法国生物梅里埃公司）进行菌株鉴定。采用纸片扩散法进行体外药物敏感性试验。药物敏感性试验纸片[氨苄西林（10 μg/片）、阿莫西林-克拉维酸（20/10 μg/片）、头孢曲松（30 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、四环素（10 μg/片）、红霉素（15 μg/片）、复方磺胺甲噁唑（25 μg/片）]购自英国OXOID公司，培养基为M-H琼脂平板（上海科马嘉公司），35 ℃培养18 h。抑菌圈直径判读依据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M45文件[6]相关标准。分离菌株送上海伯杰生物科技有限公司进行全基因测序。

2 结果

2.1 细菌培养及鉴定结果

患者右足伤口脓液于35 ℃、5% CO2环境中培养24 h后，血平板和巧克力平板可见湿润光滑、灰白色不溶血菌落生长（图1），麦康凯平板未见细菌生长。细菌经革兰染色为阴性，氧化酶、触酶均为阳性，镜下可见革兰阴性球杆菌（图1）。VITEK 2-Compact全自动微生物分析鉴定系统鉴定为犬巴斯德菌，可信度99%。再次取伤口脓液送细菌培养，鉴定结果仍为犬巴斯德菌。

图1 犬巴斯德菌血平板及镜下菌落形态

2.2 体外药物敏感性试验结果

抑菌圈直径分别为：氨苄西林27 mm、青霉素33 mm、阿莫西林克拉维酸30 mm、头孢曲松34 mm、左氧氟沙星30 mm、四环素30 mm、阿奇霉素28 mm、红霉素19 mm、复方磺胺甲噁唑28 mm。体外药物敏感性试验结果显示，本临床分离株对青霉素、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林、头孢曲松、左氧氟沙星、四环素、阿奇霉素、复方磺胺甲噁唑均敏感，对红霉素耐药。结合药物敏感性试验结果和文献查阅，建议临床改用青霉素钠，同时对患者进行清创术和加强伤口护理，患者于8月31日痊愈出院。

2.3 全基因测序结果

鉴于本犬巴斯德分离菌株对β-内酰胺类抗菌药物如氨苄西林、青霉素、头孢曲松等均敏感，但临床用药头孢呋辛钠效果不佳，怀疑存在该菌耐药表型和耐药基因型不一致的情况。对分离菌株进行全基因测序，测序结果显示：基因组大小为6 136 728 bp，GC含量为36.82%。采用BLAST软件预测在基因组中存在的与抗菌药物抗性相关的基因，采用E-value进行BLAST比对，临界值设置为1×106，氨基酸序列的一致性>45%，且序列比对的长度与其序列长度的比值≥70%（表1）。结果显示，该菌株基因组含有18种耐药基因（tuf2、MacB、mdtK、tet35、hns、parE、parC、gyrA、rpoB、rpoC、crp、basR、fol、gyrB、strA、dfrA3、cpxR、tet34）、19种抗菌药物靶基因和2种抗菌药物合成基因，未发现β-内酰胺类抗菌药物相关耐药基因，但发现其基因组中携带喹诺酮类耐药决定区域（DNA旋转酶和拓扑异构酶）编码基因parC、parE、gyrA和gyrB，测序结果未见该耐药决定区域相关耐药基因的突变。

3 讨论

人类被狗或猫咬伤后的伤口感染包含多种需氧及厌氧的混合菌群（与咬伤动物的口腔菌群吻合）[3]。TALAN等[4]发现，狗咬伤中最常见的需氧菌和厌氧菌分别是巴斯德菌属（50%）、链球菌属（46%）、葡萄球菌属（46%）、梭杆菌属（32%）及拟杆菌属（30%）。有研究结果显示，犬巴斯德菌是狗咬伤伤口感染中最常（26%）被分离到的细菌[3]。因犬巴斯德菌在麦康凯平板上不生长，易被忽视。

临床对于狗或猫咬伤患者经验性用药应包括抗巴斯德菌属、链球菌属、葡萄球菌属和梭杆菌属感染的抗菌药物，推荐使用β-内酰胺酶抑制剂、二代头孢菌素，联合使用青霉素和第一代头孢类药物或克林霉素和氟喹诺酮类抗菌药物[5]。巴斯德菌属通常对大多数抗菌药物敏感，其中氟喹诺酮类和β-内酰胺类抗菌药物是针对巴斯德菌属感染最有效的药物[6-7]。本研究分离到的犬巴斯德菌对氨苄西林、青霉素、阿莫西林-克拉维酸、头孢曲松、左氧氟沙星和复方磺胺甲噁唑均敏感，仅对红霉素耐药，但临床经验使用头孢呋辛钠控制感染效果不佳。有研究发现青霉素对巴斯德菌属、梭杆菌属及梭菌属等非常有效[8]。结合体外药物敏感性试验结果，我们与临床沟通，建议改用青霉素钠进行治疗，抗感染治疗有效。

本研究全基因测序未发现该基因组中含有β-内酰胺类抗菌药物相关耐药基因，但发现其基因组中携带喹诺酮类耐药决定区域（DNA和拓扑异构酶）编码基因gyrA、gyrB、parC和parE。喹诺酮类药物作用靶点主要是能结合于细菌DNA复制过程中的2种关键酶——DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，其中DNA促旋酶A亚单位是喹诺酮类药物对革兰阴性菌的主要靶点，而拓扑异构酶Ⅳ是革兰阳性菌的主要靶点，这些细菌酶靶点的抑制会干扰细菌分裂和基因表达而达到杀菌的作用。 目前革兰阴性菌喹诺酮类药物耐药机制分为2类：一类为细菌的DNA促旋酶A亚单位（GyrA、GyrB）和拓扑异构酶Ⅳ C亚单位（ParC、ParE）编码基因突变，最易发生耐药相关突变的是gyrA基因第83号丝氨酸、87号天门冬氨酸以及parC基因第79号色氨酸和83号天门冬氨酸[9]，该区域被称为喹诺酮耐药决定区（QRDR）；另一类为由质粒介导的喹诺酮类耐药相关基因qnrA、B、C、D、S5个qnr基因的变异体、aac（6'）-Ib-Cr[10]以及qepA基因[11]，本研究分离菌株全基因测序未发现aac（6'）-Ib-Cr、qnr、qepA及其同源序列的存在。本研究分离株基因组中虽携带了喹诺酮类药物耐药基因parC、parE、gyrA和gyrB，但测序结果未见该耐药决定区域相关耐药基因的突变，但细菌的耐药与其对抗菌药物选择压力基因突变有关，鉴于目前已有文献[12]报道犬巴斯德菌对青霉素耐药及对β-内酰胺类抗菌药物过敏患者，所以喹诺酮类药物可能会成为治疗犬巴斯德菌感染患者的首选药物，其耐药性可能会迅速发展。

随着宠物的流行，人类犬巴斯德菌相关感染可能会日趋普遍。鉴于犬巴斯德菌基因组携带有喹诺酮类药物相关耐药基因，喹诺酮类药物作为治疗犬巴斯德菌感染的最有效药物之一，随着药物的长期使用，其耐药性可能会快速发展，应引起临床重视。