表观健康儿童人类白细胞分化抗原B27参考区间的建立

张 利，葛 亮，张兰芳，马小力，孙林春

（1.江苏省中医药研究院 南京中医药大学附属中西医结合医院检验科，江苏 南京 210009；2.南京医科大学附属儿童医院儿科研究所，江苏 南京 210008）

人白细胞抗原B27（human leukocyte antigen-B27，HLA-B27）与成人强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）密切相关，甚至直接参与了AS的发病。BREWERTON等[1]的研究结果显示，HLA-B27与AS之间有很强的遗传相关性，AS患者中HLA-B27的阳性率可达90%。此外，HLA-B27在其他脊椎关节病，如反应性关节炎[2]、银屑病关节炎[3]等患者中的阳性率也高于正常人。因此，HLA-B27对脊柱关节病的诊断和鉴别诊断有重要的参考价值。流式细胞术是目前检测外周血淋巴细胞HLA-B27表达的主要方法，但尚缺乏统一的参考区间，各临床实验室多采用试剂厂家提供的参考区间，也有一些临床实验室自行建立参考区间，但这些参考区间均只针对成年人群，尚未见儿童HLA-B27参考区间的报道[4]。风湿免疫学专家大多认为幼年起病的慢性关节炎是一种异质性疾病，以往这类疾病分类无统一标准，尤其是脊柱关节疾病的命名更为混乱。国际风湿病学会联盟（the International League of Associations for Rheumatology，ILAR）于2004年正式发布了幼年特发性关节炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）的定义：16岁以下儿童持续6周以上，且排除其他疾病的不明原因关节肿胀，称为幼年特发性关节炎[5]。ILAR发布的相关标准中将JIA分为7个亚型，将以往概念中的幼年强直性脊柱炎归入JIA的附着点炎症相关型（enthesitis related arthritis，ERA）。目前，大多研究认为7个JIA亚型中，只有ERA与HLA-B27密切相关，ERA患儿成年后大多进展为AS[6]。近年来，HLA-B27对儿童ERA的辅助诊断作用逐渐得到临床的认可和重视。然而，儿童由于免疫系统尚未发育完全，HLA-B27的参考区间较成人可能存在较大差异，建立儿童HLA-B27的参考区间对于指导临床诊疗至关重要。为此，本研究拟建立南京地区表观健康儿童HLA-B27的参考区间，并将其与厂商提供的参考区间作比较，探讨二者之间的差异，以期为临床诊疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 参考区间建立人群 选取2015—2018年在南京医科大学附属儿童医院因病就诊或进行健康体检的儿童460例，其中男255例、女205例，年龄2～16岁，其中<3岁19例、3～<6岁95例、6～<12岁248例、≥12岁98例。根据临床诊断，460例儿童中上呼吸道感染251例、腹泻88例、下呼吸道感染72例、先天性心脏病25例、腺样体肥大24例。所有儿童均无ERA自觉症状，体格检查示无脊柱、外周关节、关节周围组织炎症或其他病变，且相关实验室指标无异常，排除可能对会对HLA-B27检测结果造成影响的疾病。

1.1.2 参考区间验证人群 选取2018年1—12月在南京医科大学附属儿童医院行健康体检的表观健康儿童200名，其中男121名、女79名，年龄5～14岁，均无ERA自觉症状，体格检查示无脊柱、外周关节、关节周围组织炎症或其他病变，实验室常规检测项目均无异常。另选取同期南京医科大学附属儿童医院依据ILAR相关标准确诊为ERA的患儿50例，其中男27例、女23例，年龄6～15岁。

1.2 仪器和试剂

FACSCantoⅡ流式细胞仪及配套HLA-B27试剂盒、溶血素购自美国BD公司。

1.3 方法

采用乙二胺四乙酸抗凝管采集所有对象清晨空腹静脉血2 mL，颠倒混匀。取Falcon流式细胞管，加入100 μL外周血，再加入抗HLA-B27/抗CD4-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）抗体，涡旋仪震荡混匀，室温避光孵育15 min，加入1 mL 1×溶血素，混匀后室温避光孵育15 min，加入2 mL磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS），1 200×g离心5 min，弃上清，加入0.9% NaCl溶液200 μL重悬细胞，上机检测，以CD3-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的T淋巴细胞设门，检测门内细胞HLA-B27表达的平均荧光强度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。采用单样本K-S检验进行正态性检验。呈偏态分布的数据以中位数（M）[百分位数（P2.5～P97.5）]表示，组间均数比较采用非参数Kruskal wallis检验。不同参考区间比较采用一致性检验，以kappa值判断2个参考区间的一致性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 460例儿童HLA-B27检测结果的分布

单样本K-S检验结果显示，460例儿童的HLA-B27平均荧光强度检测结果呈偏态分布（Z=1.615，P=0.011），为100（78～121）。

2.2 儿童HLA-B27参考区间的建立

2.2.1 不同年龄儿童HLA-B27平均荧光强度的比较 不同年龄儿童HLA-B27平均荧光强度差异无统计学意义（χ2=3.438，P=0.329）。见表1。

表1 不同年龄儿童HLA-B27平均荧光强度的比较 M（P2.5～P97.5）

2.2.2 不同性别儿童HLA-B27平均荧光强度的比较 不同性别儿童HLA-B27平均荧光强度差异无统计学意义（χ2=3.766，P=0.282）。

表2 不同性别儿童HLA-B27平均荧光强度 M（P2.5～P97.5）

2.2.3 儿童HLA-B27参考区间的建立 由于不同年龄和性别儿童HLA-B27检测结果差异均无统计学意义（P>0.05），且HLA-B27只在升高时才有临床意义，因此合并数据后采用百分位数法建立单侧97.5%的参考区间。本地区儿童HLA-B27的参考区间为<121。

2.3 本研究建立的参考区间与厂商参考区间的一致性比较

厂商提供的正常人外周血T淋巴细胞HLA-B27平均荧光强度的参考区间为0～147。对2个参考区间进行一致性比较，结果显示一致性较差（kappa=0.013，P<0.001）。

2.4 新参考区间的验证

根据厂商提供的参考区间，200名表观健康儿童中有6名HLA-B27检测结果为升高，异常率为3%；根据本研究建立的新参考区间，200名表观健康儿童中有10名升高，异常率为5%；共有4名结果不一致，占总人数的2%。二者异常率差异无统计学意义（χ2=1.41，P>0.05）。

根据厂商提供的参考区间，50例ERA患儿中有13例HLA-B27阳性，阳性率为26%；根据本研究建立的新参考区间，50例ERA患儿中有39例HLA-B27阳性，阳性率为78%。二者阳性率差异有统计学意义（χ2=49.18，P<0.001）。

3 讨论

流行病学调查结果显示，AS患者HLA-B27阳性率可高达95%，而正常人群的HLA-B27阳性率在10%以下；HLA-B27携带者的AS相对发病风险为70%，HLA-B27阳性的AS患者其一级亲属发生AS的概率是正常家系的11倍，呈现出明显的家族聚集性[7]。ASQUITH等[8]在转入人类HLA-B27基因的大鼠中观察到多种与人类AS相似的临床表现，而携带HLA-B27基因数量少的大鼠则未出现关节炎等AS表现。虽然AS的发病机制不明，但目前已经公认HLA-B27与AS的发病相关。

ERA是儿童常见的慢性风湿性疾病之一，早期症状不典型，且未成年人的骨骼尚在发育，一些发育时期关节的正常表现，如骶骨骨骺、关节面的局限性凹陷、髂骨侧关节面的囊样改变也与ERA的病理特征相似[9]，这给临床诊断增加了难度。近年来，HLA-B27在ERA的辅助诊断中逐渐得到临床的认可和重视。然而，目前采用的HLA-B27参考区间多为成人参考区间，且由厂商提供。由于儿童有其特有的生长发育规律，与成人之间存在较大的生理差异，因此某些检测项目的参考区间可能不适用于儿童。我们在实际工作发现，一些被诊断为ERA的患儿，其HLA-B27根据现有的参考区间被判断为阴性，虽然HLA-B27阳性与ERA之间的符合率并非100%，但这也提示HLA-B27的表达情况在成人与儿童之间可能不完全一致。因此，有必要建立未成年人HLA-B27的参考区间。

本研究用于建立参考区间的儿童均无ERA自觉症状，无脊柱、外周关节、关节周围组织炎症或其他病变，临床和实验室检查也无其他AS相关指标异常，所得结果能真实、可靠地反映儿童HLA-B27的表达情况。本研究结果显示，460例儿童外周血T淋巴细胞HLA-B27平均荧光强度数据呈偏态分布，且不同年龄和性别儿童差异均无统计学意义（P>0.05），因此合并数据后采用百分位数法建立单侧97.5%的参考区间，结果为<121。建立的新参考区间与厂商提供的参考区间的一致性较差（kappa=0.013，P<0.001）。用2个一致性有显著差异的参考区间分析同一个检测结果时，很可能会出现完全不同的结论[10]。为此，本研究另选取200名表观健康儿童对新参考区间进行验证。结果显示，根据新参考区间，200名表健康儿童HLA-B27的异常率为5%，50例ERA患儿的HLA-B27阳性率为78%；根据厂商提供的参考区间，200名表观健康儿童HLA-B27的异常率为3%，50例ERA患儿的HLA-B27阳性率为26%；二者异常率差异无统计学意义（χ2=1.41，P>0.05），阳性率差异有统计学意义（χ2=49.18，P<0.001）。说明采用2种参考区间得出的HLA-B27特异性均较好，误诊率较低；但采用新参考区间得出的HLA-B27敏感性优于厂商提供的参考区间，使用厂商提供的参考区间可能会造成一部分ERA患儿漏诊。

虽然HLA-B27在所有有核细胞表面都表达，但其主要表达于淋巴细胞表面。未成年人的免疫系统尚在发育中，免疫细胞表面抗原可能未分化完全或未充分暴露，这可能导致未成年人淋巴细胞表面HLA-B27平均表达强度低于成人，因此使用成人参考区间可能会造成漏诊。由于HLA-B27与儿童ERA高度相关，因此根据参考区间准确判断HLA-B27阳性对于ERA的辅助诊断和鉴别诊断具有重要价值，尤其是对于依据现有临床表现和影像学检查仍难以作出明确判断的患儿。此外，对有HLA-B27阳性家族史，根据参考区间判断HLA-B27阳性但尚无ERA临床症状或骨骼改变的儿童，临床建议定期复查，早期发现，及时采取药物控制、心理干预、行为干预和运动指导等综合治疗措施，对于成年后延缓疾病进展，提高生活质量有重要作用。

综上所述，本研究建立了南京地区儿童外周血HLA-B27的参考区间，依据该参考区间诊断ERA的特异性与厂商提供的参考区间无差异，但提高了诊断敏感性，降低了漏诊率。