低剂量双酚A通过调控PPARγ致小鼠糖脂代谢紊乱的研究

龙 子，樊隽澍，吴光源，王 欣*，海春旭*

(空军军医大学军事预防医学院毒理学教研室，特殊作业环境危害评估与防治教育部重点实验室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，陕西 西安 710032)

自20世纪90年代以来，以非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)为代表的代谢性疾病发病率急剧上升，并且患病人数仍在逐年增加。NAFLD的特征是肝脏存在脂肪异位和脂肪变性[1]。其病理特征包括从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)等多种改变，可发展为肝硬化等终末期肝脏疾病，甚至能够导致肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[2]。然而，NAFLD等代谢性疾病发病率升高的原因尚不清楚。大多数相关研究将高热量饮食和不健康的生活方式作为关注点，但随着社会的发展，人们逐渐意识到环境因素在代谢性疾病中起到的重要作用[3]。最近的流行病学、动物实验以及临床研究表明，一些环境污染物可能对人体内分泌和代谢功能产生严重影响，从而促进代谢性疾病的发生[4]。

在代谢性疾病发病率快速上升之前，以双酚A(bisphenol A，BPA)为代表的合成化学品的种类和用量呈指数级增长[5]。BPA于1891年首次合成，1957年开始用于制作塑料瓶的材料，从此，BPA成为了聚碳酸酯塑料和环氧树脂制造中使用最广泛、合成最方便的增塑剂之一。BPA是一种典型的内分泌干扰物(endocrine disrupting chemical，EDC)，在体内可能发挥了雌激素类似物的作用[6]。BPA具有高亲脂性，容易蓄积在脂肪组织及细胞内。有研究表明，高脂饮食(high fat diet，HFD)喂养的小鼠与标准饮食喂养的小鼠间存在代谢方面的差异[7]。因此，我们将BPA暴露的小鼠联合HFD喂养，观察二者是否存在协同作用。

许多日常生活用品中都有BPA的存在，如婴儿奶瓶、医疗材料、牙科设备和热敏纸(例如收据和机票)等[6，8]。BPA在日常饮用水中的浓度为0.014～0.317 μg/L，在塑料材质包装的瓶装水中的浓度为0.07～4.21 μg/L[9-10]。由于人类接触BPA的途径非常广泛，因此在普通人体的血浆、尿液甚至母乳中都能够检测到其存在[6，11-13]。研究表明，人群血清中的BPA水平在0.000 2～66 ng/mL的范围之间[14-17]。美国环境保护署制定的BPA每日可耐受摄入量(tolerable daily intake，TDI)为50 μg/(kg·d)，但最近的研究表明，目前世界上现有安全限值以下剂量的BPA暴露同样有可能对于民众的健康产生损害效应。因此，低剂量BPA暴露对机体的影响仍有待进一步研究。

现阶段的研究结果提示，BPA能够影响发育水平[18]，降低生育能力[19-20]和诱发肥胖[21]，导致包括NAFLD在内的代谢疾病[22-23]，甚至癌症[24]。但BPA暴露能否导致肝脏发生糖脂代谢紊乱及其相关机制仍不清楚。本研究设计了体内及体外实验来研究BPA暴露对糖脂代谢功能的影响，揭示BPA暴露与糖脂代谢紊乱的关系及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

实验中所用C57BL/6J雄性小鼠购自空军军医大学实验动物中心；BPA购自美国Sigma公司；HFD饲料购自江苏美迪森公司；人参皂苷Rh1(Rh1)购自美国MCE公司；BODIPY 493/503染料购自美国Invitrogen公司；L02细胞购自ATCC；棕榈酸(palmitic acid，PA)购自美国Sigma公司。

1.2 实验分组与动物模型

所有实验均按照空军军医大学动物福利和使用委员会批准的程序进行。小鼠在恒温[(23±1)℃]和恒湿[(55±5)%]条件下饲养，并遵循严格的12 h/12 h明暗周期。为了尽量减少实验处理之外的BPA暴露，我们使用聚苯乙烯鼠笼饲养动物。将60只小鼠随机分为5组：对照组及1、10、100、1 000 μg/(kg ·d)BPA组。BPA组每天分别按照相应剂量灌胃给药，暴露时间为8周。测定脂质积累相关指标后，选择变化最为明显的剂量组作为本研究的实验剂量进行后续研究。将另外60只小鼠随机分为5组：对照组、HFD组、BPA组、BPA联合HFD组、BPA联合Rh1组。HFD组与BPA联合HFD组在饲养过程中使用脂肪含量为45%的高脂饲料喂养8周。BPA组、BPA联合HFD组及BPA联合Rh1组给予10 μg/(kg·d)BPA灌胃给药处理。从BPA给药的第5周开始，BPA联合Rh1组同时给予20 mg/(kg·d)Rh1灌胃处理，给药时间为4周。处理结束后，将小鼠禁食8 h，用戊巴比妥钠麻醉，实施安乐死后收集血清，称取肝组织质量，制作肝组织病理切片及冰冻切片，将剩余肝组织冷冻于-80℃冰箱保存待用。

1.3 空腹血糖水平、IPGTT和IPITT实验

在实施安乐死前，采用剪尾法测定小鼠空腹血糖水平。腹腔糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)用于检测葡萄糖负荷对代谢活动的影响，腹腔胰岛素耐量实验(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)用于测定小鼠的胰岛素抵抗程度。IPGTT和IPITT实验在动物安乐死前1周进行，两次实验之间有3 d的间隔。禁食8 h后，测定小鼠尾静脉血液的基础血糖水平，使用1 g/kg的D-葡萄糖溶液或0.75 U/kg的胰岛素进行腹腔内注射，分别在注射后30、60和120 min测量血糖水平，并计算曲线下面积。

1.4 肝组织生化测定

使用甘油三酯(triglyceride，TG)检测试剂盒，采用比色法测定肝脏中TG水平。

1.5 细胞培养及处理

L02细胞使用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素(100 μg/mL)的DMEM高葡萄糖培养基，在37℃、CO2体积分数为5%的条件下进行培养。细胞使用1或10 μmol/L的BPA培养48 h后进行处理。20 μmol/L的PA处理24 h用于促进L02细胞脂质积累。使用100 μmol/L的Rh1处理24 h抑制过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)的生成。

1.6 葡萄糖吸收水平检测

L02细胞使用1或10 μmol/L的BPA处理48 h后，采用2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxyglucose(2-NBDG)法测定细胞的葡萄糖吸收程度。将L02细胞与2-NBDG荧光剂(使用无葡萄糖培养基稀释，终浓度为100 μg/mL)在100 μmol/L胰岛素的条件下，在37℃孵箱内孵育30 min(根据不同实验条件，最多可孵育至16 h)。在BPA处理24 h后，使用BPA和100 μmol/L Rh1继续共处理24 h。使用全波段酶标仪测定2-NBDG的含量。

1.7 脂肪酸吸收水平检测

采用脂肪酸吸收测定试剂盒测定L02细胞脂肪酸吸收水平。将细胞用1或10 μmol/L BPA处理48 h，在BPA处理24 h后，使用BPA和100 μmol/L Rh1共处理或使用BPA和20 μmol/L PA共处理24 h。将每组样品在无血清培养基中饥饿处理1 h。处理完成后，将100 μL脂肪酸染料稀释液加入样品中，继续孵育60 min。使用全波段酶标仪测定样品荧光强度。

1.8 肝组织及细胞染色

将肝组织固定在4%多聚甲醛溶液中，用石蜡包埋。使用苏木精和伊红染液按照标准步骤对石蜡包埋组织切片进行HE染色。为了检测组织或细胞中的脂质积累，使用冰冻切片进行油红O染色。使用4%多聚甲醛固定L02细胞或小鼠肝组织，用BODIPY 493/503染料进行荧光染色。使用光学显微镜观察HE和油红O的染色情况，使用激光共聚焦显微镜观察BODIPY染色情况。

1.9 糖原含量测定

采用糖原含量检测试剂盒，通过比色法检测小鼠肝组织和L02细胞中的糖原含量。

1.1 0 实时荧光定量PCR

小鼠肝组织和L02细胞中的RNA使用总RNA提取试剂盒进行分离。使用TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒将500 ng RNA逆转录为cDNA。反应试剂使用SYBR Green PCR试剂盒，取1 μL cDNA用于20 μL反应体系。引物信息见表1。PCR反应过程的简要说明如下：95℃预变性10 min；95℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1 min(以上3步进行30个循环)；在72℃下延伸5 min。mRNA的相对含量使用法计算，β-actin用作内参。

表1 引物信息

1.11 统计学方法

数据表示为±s。两组之间差异的分析采用t检验。使用单因素方差分析(ANOVA)计算多组间的差异，如差异有统计学意义，则使用Newman-Keuls法进行两两组间的比较分析。所有数据均使用GraphPad Prism 7.0和SPSS 17.0统计软件进行分析，以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 BPA暴露对小鼠肝脏脂质积累的影响

不同剂量BPA暴露对小鼠肝脏脂质积累的影响见图1。在不同剂量[1、10、1 000 μg/(kg· d)]BPA处理的小鼠模型中，小鼠肝脏质量显著增加(P均＜0.01)。检测肝组织TG含量发现，10 μg/(kg·d)BPA组小鼠肝脏TG水平明显升高(P均＜0.01)。形态学实验结果可见，在10 μg/(kg·d)BPA组小鼠肝脏HE染色结果中观察到的空泡样结构最为明显。肝组织油红O染色结果可见，4个剂量组的小鼠肝脏均存在不同程度的脂质积累，但10 μg/(kg·d)BPA组脂质积累的程度最高，范围最广。结果显示，不同剂量的BPA暴露未表现出明显的剂量-效应关系，使用10 μg/(kg·d)的暴露剂量时产生的损伤效应最强，因此在后续实验中我们选择该剂量进行进一步研究。

图1 不同剂量BPA暴露对小鼠肝脏脂质积累程度的影响

2.2 BPA暴露对小鼠糖脂代谢的影响

BPA暴露对小鼠脂代谢的影响如图2所示，BPA暴露提高了雄性小鼠肝脏TG水平。与单纯HFD饲养组相比，BPA+HFD组的肝脏TG水平明显升高，并且其肝脏脂质积累明显增加，脂滴形成的数量明显增多。BPA暴露对小鼠葡萄糖代谢的影响如图3所示，测量葡萄糖代谢相关指标，BPA暴露小鼠空腹血糖水平显著升高。由IPGTT与IPITT实验结果可知，与对照组相比，BPA暴露的小鼠糖耐量降低，并产生胰岛素抵抗现象，曲线下面积明显增大。BPA+HFD组明显加重了HFD诱导的糖耐量异常及胰岛素抵抗现象。糖原含量检测结果显示，BPA暴露的小鼠肝脏中的糖原含量显著增加。

图2 BPA单独暴露或联合HFD对小鼠肝脏脂质积累的影响

2.3 BPA暴露对L02细胞的糖脂代谢影响

不同剂量BPA暴露对L02细胞脂质积累程度的影响如图4所示。体外实验表明，在L02细胞中，随着BPA处理浓度的增加，脂肪酸积累程度增加。脂肪酸吸收程度、油红O染色强度及糖原含量测定显示，细胞内脂质含量和糖原含量均有所增加，而胰岛素刺激的葡萄糖吸收程度显著降低。10 μmol/L BPA表现出更为显著的效果，因此在体外实验中选择了该剂量进行后续验证。BPA暴露对L02细胞糖脂代谢的影响如图5所示。BPA暴露增强了L02细胞脂肪酸吸收能力，并提高了PA诱导的脂肪酸吸收程度。BPA显著增加了PA诱导的脂质蓄积。糖原含量检测结果表明，BPA暴露使L02细胞中糖原含量显著增加。

2.4 BPA暴露影响体内及体外肝细胞糖脂代谢关键调控因子的表达

图3 BPA单独暴露或联合HFD对小鼠糖代谢相关指标的影响

图4 不同剂量BPA暴露对小鼠肝脏脂质积累程度的影响

图6的结果表明，BPA可以导致肝组织及体外肝细胞中一系列脂肪生成调控因子的表达水平发生改变。BPA暴露显著升高了固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding protein 1，SREBP1)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-coenzyme A desaturase 1，SCD-1)的mRNA表达水平，并且降低了乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase 1，ACC-1)和 PPARα的mRNA表达水平。在BPA暴露的L02细胞中SREBP1、FASN、ACC-1和SCD-1 mRNA表达水平同样升高。与对照组相比，BPA在体内和体外可使PPARγ mRNA表达水平明显上升。BPA+HFD组的小鼠肝脏和BPA+PA处理的L02肝细胞中，PPARγ mRNA表达与单纯HFD饲养的小鼠或单纯PA处理的L02细胞相比显著上调。

图5 BPA单独暴露或联合PA对L02肝细胞脂质积累及糖代谢相关指标的影响

图6 BPA体内及体外暴露对一系列脂肪生成调控因子mRNA表达水平的影响

2.5 PPARγ参与BPA诱导的体内及体外糖脂代谢紊乱

图7 BPA联合Rh1对小鼠肝脏脂质积累及糖代谢相关指标的影响

为了验证PPARγ是否在BPA诱导的肝脏代谢功能障碍中起关键作用，我们使用BPA联合Rh1对小鼠肝脏脂质积累及糖代谢相关指标进行检测，结果见图7。PCR结果显示，Rh1明显抑制了BPA诱导的PPARγ表达的增加。与BPA暴露组相比，Rh1处理的BPA暴露小鼠TG含量明显降低。BPA+Rh1处理可显著减少BPA诱导的肝脂质滴合成，明显改善脂质蓄积。糖原含量测定结果显示，Rh1可以明显降低BPA暴露小鼠肝脏中的糖原含量。

在体外培养的L02肝细胞中，使用BPA联合Rh1进行处理，对L02细胞的脂质积累及糖代谢相关指标进行检测，结果见图8。与BPA暴露组相比，BPA+Rh1组中PPARγ表达水平明显降低。Rh1能够降低BPA暴露诱导的脂肪酸吸收程度，明显改善脂质积累情况。L02细胞中糖原含量有所降低，胰岛素刺激的葡萄糖吸收程度明显缓解。

3 讨论

目前，BPA是一种无处不在的合成化学品，多项研究表明，持续接触BPA可能与多种疾病密切相关，包括性功能障碍、代谢紊乱、心血管疾病和肥胖[15，23，25-31]等。大量证据显示，人们日常广泛使用的许多由高分子聚合物制作的产品中，都存在着BPA浸出的现象，以至于其可以通过饮食饮水的方式在不经意间暴露，从而危害人体健康。除了消化道摄入之外，皮肤接触购物小票和机票等热敏纸材料是人体接触BPA的另一个重要来源，研究表明手持其5 s即可将BPA高效的转移到皮肤上[32-33]。

在本研究中，我们首先建立了不同剂量BPA处理的小鼠暴露模型，观察并检测其肝脏中脂质积累情况，以判断是否发生了脂代谢异常的现象。在4个不同浓度BPA处理的小鼠模型中，均存在肝脏脂质积累增加的趋势，但10 μg/(kg·d)暴露剂量导致的损伤程度显著高于另外3组[1、100、1 000 μg/(kg · d)]。利用小鼠体内暴露模型以及L02肝细胞的体外实验研究BPA暴露是否与糖脂代谢紊乱相关，并进一步探索其可能的相关机制。

我们发现BPA暴露的小鼠肝脏和L02细胞中产生了脂代谢紊乱的现象，由于脂代谢异常在葡萄糖代谢功能障碍中发挥基础性作用，我们继续研究BPA暴露对小鼠及细胞葡萄糖代谢的影响，发现在体内及体外同样存在严重的糖代谢紊乱现象。同时，我们重点关注了BPA联合HFD对肝脏糖脂代谢的影响。结果发现，在小鼠肝组织中，BPA联合HFD均可以显著诱导肝脏TG水平升高，脂质积累增加，并且BPA联合HFD对肝脏糖代谢异常及产生胰岛素抵抗的作用显著增强，提示BPA能够加重HFD诱导的糖脂代谢紊乱。

图8 BPA联合Rh1对L02肝细胞脂质积累及糖代谢相关指标的影响

由于BPA在体内及体外暴露均显示出了明显的脂质积累和葡萄糖代谢异常，因此我们测定了一系列与脂质代谢调控相关基因的mRNA表达，以探讨导致差异产生的可能原因。我们发现肝脏脂质代谢异常和相关血糖异常发生的潜在机制可能与脂肪酸从头合成、甘油三酯合成与脂肪形成等过程的激活有关，并伴随脂肪酸氧化的减少。这些数据表明脂肪酸从头合成和甘油三酸酯合成的激活可能是BPA暴露诱导的脂质代谢异常的重要机制。与其他研究相比[4，34-35]，我们的研究选择了更低的剂量来全面验证了BPA暴露是否会对小鼠肝脏糖脂代谢产生类似的影响。

PPARγ是脂质吸收与合成的关键调控因子[36]，在BPA暴露的小鼠肝脏和L02肝细胞中，其mRNA表达水平显著升高，并且加重了HFD诱导的PPARγ表达量增加。人参皂苷Rh1是一种PPARγ的抑制剂[37-38]，使用Rh1抑制PPARγ的表达，发现脂质积累程度明显减轻。结果显示，PPARγ的上调与体内或体外BPA暴露引起的肝脏脂质积累和葡萄糖代谢功能障碍有关，抑制其表达水平可以在一定程度上改善BPA导致的糖脂代谢紊乱发生，说明其可能是潜在的参与BPA诱导糖脂代谢紊乱的关键分子。

本研究仍存在一定的局限性，在后续研究中还需要解决以下问题：①我们分别使用0、1、10、100、1 000 μg/(kg·d)的BPA进行暴露，但结果缺乏剂量-效应关系，高剂量BPA暴露的变化并不显著。为何表现出了明显的低剂量效应仍有待研究。②我们仅选择了变化最显著的剂量10 μg/(kg·d)进行研究，但1 μg/(kg·d)的BPA同样引起了小鼠的糖脂代谢紊乱。观察更低剂量BPA暴露是否对机体产生不良影响具有更大的实际意义。

综上所述，本研究明确了10 μg/(kg·d)的BPA暴露在小鼠体内产生显著的肝脏脂质积累和葡萄糖代谢紊乱，并且BPA和HFD在糖脂代谢紊乱中存在协同作用。BPA通过调控一系列脂质代谢相关基因，在体内及体外产生明显的脂质积累，从而引起糖脂代谢紊乱现象的发生。抑制PPARγ的表达水平可显著改善由BPA暴露导致的脂质合成增加以及葡萄糖代谢异常，说明PPARγ可能在BPA诱导的糖脂代谢紊乱中发挥关键作用。本研究为BPA暴露的剂量参考限值以及BPA诱导的糖脂代谢紊乱的病理机制提供了新的见解，并对后续进一步的深入研究提供了新的思路。