电针对脑缺血大鼠缺血皮质区内皮型一氧化氮合酶及血清中一氧化氮含量的影响

何 鹏，唐 巍，童明月，丰丽媛，王 玉，姚晓雯，李梦醒

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学针灸推拿学院，安徽 合肥 230012)

脑卒中分为缺血性和出血性两类，其中缺血性脑卒中占脑卒中总数的60%以上，发病率、致残率高，是60岁以上人群首要死亡病因[1-2]。缺血性脑卒中病灶的病理变化主要为缺血低氧引起的脑组织水肿以及神经细胞凋亡。以往许多研究[3]着眼于对神经细胞的调控以降低脑缺血后损伤，而忽略新生微血管在促进神经功能恢复方面的作用。近来有研究[4]表明，脑梗死区域的新生微血管具有改善局部血流灌注，促进侧支循环形成的作用。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)是血管新生中的重要因子。文献研究[5]发现，通过正向调控血管新生相关通路[磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)/eNOS]下游因子eNOS和NO的表达，可以达到改善神经功能的目的。电针干预可增加缺血区域脑血流量，使梗死体积缩小，促进神经功能恢复，其机制可能与血管新生有关。故本实验以大脑中动脉栓塞(middle cerebralartery occlusion，MCAO)大鼠为模型，探讨电针能否通过调节血管新生相关因子eNOS、NO的表达来促进血管新生，改善神经功能缺损体征，达到脑保护作用。

1 材料

1.1 动物 健康雄性SD大鼠(SPF级)42只，体质量为280～320 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[动物生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0003]，于动物房适应性饲养1周后进行实验，动物房温度保持为20～25 ℃，湿度为60%左右，通风。本实验获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 试剂 TTC染色液:美国Sigma公司；NO试剂盒：南京建成生物工程研究所；Western 一抗、二抗去除液：Beyotime；ECL超敏发光试剂盒：Thermo；eNOS试剂盒：Bioss；β-Actin、山羊抗小鼠IgG：Zs-BIO；SDS：Solarbio。

1.3 仪器 华佗牌毫针(0.30 mm×25 mm)、华佗牌SDZ-Ⅳ型电子针疗仪：苏州医疗用品厂有限公司；Leica RM2135切片机：德国Leica；Nikon显微镜：日本Nikon；亚光YB-7B石蜡包埋机：湖北省亚光医用电子技术有限公司；自动曝光仪：上海培清科技有限公司；超低温冰箱：中国Haier公司。

2 方法

2.1 电针干预方法 参照《实验针灸学》[6]，结合大鼠解剖结构进行定位，电针组取“百会”“风府”“心俞”“内关”4个穴位，以模型复制后4 h为第1天开始治疗，取0.30 mm×25 mm毫针针刺大鼠以上4个穴位，连接华佗牌SDZ-Ⅳ型电子针疗仪，取“百会”和“风府”为一组，同侧“内关”和“心俞”为一组，近心端穴位接正极，远心端穴位接负极，每日1次，每次20 min。电针参数：疏密波，5～100 Hz，电压3～5 V，以大鼠肢体轻度抖动不嘶叫、不挣扎为度。

2.2 动物分组及模型复制方法 随机抽取14只大鼠作为假手术组，只打开大鼠皮下组织钝性分离其颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。其余大鼠参照Longa线栓法[7]复制MCAO大鼠模型。取10%乌拉坦(1.2 g/kg)腹腔注射，麻醉(翻正反射消失)固定后，在大鼠颈部正中偏右0.5～1 cm处竖直方向剪一个2 cm左右小口，钝性分离其组织，使颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉充分暴露，在颈外动脉远心端打死结固定，并于向颅一侧凝断，轻拉游离端，使之与颈内动脉成一平角，远心端夹闭颈总动脉与颈内动脉，在游离端上45°角斜剪一小口，将蘸有清漆并过夜的合适渔线沿小口插入颈内动脉，松开动脉夹，渔线插至微有阻力处停下，固定、缝合切口，肌注0.5 mL青霉素。待大鼠清醒后遵5分制标准[8]进行神经功能缺损评分，1～3分即为模型复制成功。将最终模型复制成功的大鼠随机分为模型组和电针组两组，每组14只。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 大鼠神经功能缺损评分 各组大鼠在治疗7 d后按5分制标准[8]评分：无神经功能缺损体征者计为0分；大鼠左侧肢体屈曲，无法充分伸展计为1分；大鼠移动时偏向左侧绕圈计2分；大鼠向左侧倾倒计3分；丧失意识计4分。

2.3.2 大鼠脑梗死体积观察及检测 采用TTC染色法检测脑梗死体积。每组取6只大鼠，10%乌拉坦(1.2 g/kg)腹腔注射，麻醉后断头取脑，放入-20 ℃冰箱冻存15 min后横向连续切2 mm厚片，置于2% TTC染液中，以锡纸包裹，37 ℃水浴箱中温育20 min上色，4%多聚甲醛固定。结束后数码相机拍照，Image Pro-Plus 6.0软件测量脑梗死体积：V=l(A1+A2+A3+……+An)-(A1+An)×l/2。试中l为切片厚度，A为每张切片的梗死面积，V为梗死灶体积。

采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法观察缺血区大脑皮质病理学改变。每组取2只大鼠，取脑，切片，二甲苯常规脱蜡后水洗，伊红染色后脱水，封片，Nikon显微镜(400倍)下观察细胞病理学改变并摄片保存。

2.3.3 Western blot法检测缺血皮质区eNOS蛋白的相对表达量 每组取3只大鼠，麻醉后脱颈处死，快速取脑，剪取缺血区大脑皮质100 mg，加RIPA细胞裂解液(内含1 mmol/L PMSF)进行裂解。12 000 r/min离心10 min。取出上清液，电泳，转膜，添加一抗、二抗，ECL发光试剂盒检测蛋白，Image J软件分析目标条带灰度值，计算其相对表达量。

2.3.4 ELISA法检测大鼠外周血清NO含量 各组选取3只大鼠，麻醉后打开腹腔，手持干净棉球移开肠胃，夹闭腹主动脉后用采血针从远心端向心刺入，取血3 mL，4 ℃冰箱内保存，再按试剂盒说明取血浆进行前处理，测定NO含量。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 假手术组大鼠无神经功能缺损体征，评分皆为0分；与假手术组比较，模型组、电针组大鼠神经功能缺损体征明显(P<0.05)；与模型组比较，电针组大鼠神经功能缺损评分显著降低(P<0.05)，表明偏瘫程度较轻，神经功能恢复更好。见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

3.2 各组大鼠脑梗死体积比较 假手术组大鼠脑部切片未见明显梗死区域；与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积显著增大(P<0.05)；与模型组比较，电针组大鼠脑梗死体积显著缩小(P<0.05)。见图1、表2。

图1 各组大鼠脑梗死体积比较(TTC染色)

表2 各组大鼠脑梗死体积比较

3.3 各组大鼠缺血皮质区脑组织的组织形态学变化比较 假手术组：细胞结构完整，细胞质均匀分布，细胞核呈紫色并且形状规则，无炎症细胞浸润现象，染色均匀，细胞呈正常形态。模型组：可见大量皱缩的细胞聚集，排列紊乱，细胞核变形溶解甚至消失，细胞结构紊乱无序，形状不规则，细胞质呈蓝紫色。电针组：相对于假手术组而言，可见细胞数目明显减少，部分细胞核皱缩，细胞排列较为紊乱，细胞染色分布不均匀；相对于模型组而言，细胞结构较为清晰，染色较为均匀，细胞核形状相对规则且完整。见图2。

图2 各组大鼠缺血皮质区组织形态学变化比较(HE染色，10×40倍)

3.4 各组大鼠脑缺血皮质区eNOS蛋白表达水平和血清NO含量比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血皮质区eNOS蛋白相对表达水平和血清NO含量均显著增高(P<0.05)；与模型组比较，电针组大鼠脑缺血皮质区eNOS蛋白相对表达水平和血清NO含量均显著增高(P<0.05)。见图3、表3。

图3 各组大鼠脑缺血皮质区eNOS蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠脑缺血皮质区eNOS相对表达水平和血清NO含量比较

4 讨论

缺血性脑卒中可归属于中医学“中风”范畴，病机为气血逆乱，血瘀于脑，因其病位在脑，根据《灵枢》所言“脑为髓之海，其输上在于其盖(百会穴)，下在风府”，所以取百会、风府二穴，符合“气街”理论[9]。《医学衷中参西录》中有言“人之神在脑，心脑息息相通”，是以“心”与“脑”紧密相连，背俞穴是脏腑之气汇聚处，常被用来治疗脏腑疾病，根据“阳中求阴”理论取心的背俞穴“心俞”[10]；而心包为心之外卫，与心紧密相连，是以再配合通于阴维脉的心包经之内关穴来协调心经之气机[11]。课题组前期研究[12-15]表明，针刺可结合现代康复医学理念在脑卒中后遗症的不同阶段采用不同的针灸策略治疗偏瘫患者，电针可有效缩小大鼠脑梗死体积，改善脑卒中大鼠神经功能缺损体征，所以本实验基于“脑心同治”的治疗原则[16]选取“百会”“风府”“心俞”“内关”4个穴位进行电针干预治疗，探讨其效应机制。

缺血性脑卒中发生后，脑的供血动脉闭塞或狭窄造成脑组织缺血低氧性坏死[17]，而在缺血区域新生的微血管具有改善其周围组织血液循环灌注的作用[18]，促进周围组织中神经细胞的修复，有利于改善神经功能，故促进血管新生已成为脑卒中后的研究重点。资料[19-20]显示，当组织受损处于缺血低氧环境时，血管新生相关通路PI3K/AKT/eNOS可被激活，其下游因子eNOS磷酸化后可介导生成eNOS，这类eNOS调控生成的NO是一种可特异性作用于内皮祖细胞的血管新生因子，可以促进其特异性分泌进入外周血中，借助细胞因子的黏附作用，迁移至血管内皮破损处分化为内皮细胞，参与血管新生进程，加速微血管新生成网，促进侧支循环的建立。研究[21-23]表明，在缺血发生早期，eNOS和NO的高表达可加速血管新生过程，促进脑缺血区域的循环重建。在本实验中，电针组大鼠脑梗死体积、神经功能缺损评分、eNOS和NO表达量均显著优于模型组，提示在卒中发生后大鼠缺血皮质区eNOS含量显著下降，但经电针治疗后eNOS含量明显上升，且显著优于模型组，其所介导产生的NO含量亦显著优于模型组，这说明电针干预可有效改善大鼠神经功能缺损体征，降低脑梗死区体积，上调eNOS蛋白及NO表达量，促进缺血区域的血管新生，与以往研究结果相符。

综上所述，电针MCAO大鼠“百会”“风府”“心俞”“内关”4个穴位可上调大鼠脑缺血皮质区eNOS蛋白与NO的表达，这对于缩小脑缺血大鼠脑梗死体积，促进血管新生与神经功能恢复，支持缺血性脑卒中后侧支循环重建，减轻脑缺血带来的损伤有一定的临床意义。但是，目前对于eNOS/NO通路的基础研究成果较少，课题组后续研究可以此为重点，扩大样本量，增加脑缺血早期样本指标检测量，进一步研究电针对eNOS/NO通路作用的具体调控机制和网络，尝试阐述eNOS/NO路径发挥其生物学作用的具体机制，以及其效应随时间变化的机制等。