密蒙花中4种成分的含量测定及其主成分、偏最小二乘判别分析

汪海斌，张楠楠，洪稳稳，李 芳，闫 攀，黄艳梅

(1.国家中药材产品质量监督检验中心，安徽 亳州 236800；2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；3.亳州学院，安徽 亳州 236800)

密蒙花为马钱科醉鱼草属植物密蒙花(BuddlejaofficinalisMaxim.)的干燥花蕾及花序[1]，又名黄饭花、小锦花、染饭花等，中国西南及中南等地多有分布[2]。该药始载于宋代，《开宝本草》云：“主青盲肤翳，赤涩多泪，消目中赤脉，小儿麸痘及疳气攻眼。”密蒙花是传统中药中重要的眼科用药，具有疏风清热、养肝明目、退翳的功效，常用于目赤肿痛、多泪羞明、目生翳膜、肝虚目暗、视物昏花等症[3-6]。

密蒙花主要活性成分包括黄酮类和苯乙醇苷等类化合物[7-10]。其中，黄酮类化合物具有降血脂、保肝、抗炎等作用，其分离鉴定出的黄酮类化合物以芹菜素、蒙花苷和木犀草素为主；苯乙醇苷类化合物具有抗菌、抗炎、免疫调节等生理活性，目前密蒙花分离得到的18种苯乙醇苷类化合物中，毛蕊花糖苷为含量最高的成分。2015年版《中华人民共和国药典》仅以蒙花苷的含量作为密蒙花的质量控制标准，但密蒙花化学成分复杂，且不同产地间存在质量差异[11-12]，仅仅靠单一成分的含量测定难以全面反映密蒙花的质量内涵。因此本实验建立了同时测定密蒙花中毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素4种成分含量的超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)方法，并借助统计学软件，采用多元数据分析方法对实验数据进行分析[13]，以期为不同产地密蒙花药材质量评价提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters UPLC ACQUITY H-Class型UPLC仪、四元溶剂管理器、SM-FTN样品管理器、柱温箱、光二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站、ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)：美国waters公司；KQ-205 型数控超声清洗器：昆山超声仪器有限公司；AX224ZH万分之一天平：奥豪斯仪器(常州)有限公司；MSE225S-OCE-DU十万分之一天平：德国Sartorius公司；Milli Q型超纯水净化系统：美国 Millipore 公司。

1.2 试药 密蒙花药材由华润三九医药股份有限公司提供，经安徽中医药大学周建理教授鉴定为马钱科醉鱼草属植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾及花序；毛蕊花糖苷(批号111530-201713，纯度92.5%)、蒙花苷(批号111528-201710，纯度96.6%)、木犀草素(批号111520-201605，纯度99.6%)、芹菜素(批号111901-201603，纯度92.5%)均购于中国食品药品检定研究院；色谱级磷酸：天津市大茂化学试剂厂；乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素对照品适量，分别加入甲醇制成质量浓度分别为1.822、1.097、0.563、0.535 mg/mL的对照品储备液。取以上4种对照品储备液适量，加甲醇稀释成一定浓度的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度系统(0～2 min，5%→35% A；2～6 min，35% A；6～8 min，35% →50% A；8～10.5 min，50%→100% A；10.5～15 min，100%→5% A)；检测波长：330 nm；流速：0.15 mL/min；柱温30 ℃；进样容积2.0 μL。色谱图见图1。

注：1.毛蕊花糖苷；2.蒙花苷；3.木犀草素；4.芹菜素

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素对照品储备液适量，配制成6个质量浓度系列的混合对照品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进行测定，以对照品质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程、相关系数(r)和线性范围。结果见表1。

表1 4种成分的线性关系和线性范围

2.4.2 精密度试验 取同一混合对照品溶液在“2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积，计算毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD值分别为0.52%、0.57%、0.36%、0.39%，均小于2.0%，表明仪器精密性良好。

2.4.3 重复性试验 取S17批密蒙花药材，按“2.2”下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照“2.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，测得各成分含量，计算毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD值分别为0.71%、0.63%、0.66%、0.58%，均小于2.0%，表明本方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取S17批密蒙花药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h 后按照“2.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，计算毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD分别为0.98%、0.89%、0.86%、0.71%，均小于2.0%，结果表明24 h内供试品溶液的稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已测定的密蒙花粉末(S17)6份，每份0.2 g，分别加入毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素对照品储备液各2.0、2.5、0.16、0.24 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，记录色谱峰峰面积，计算回收率。结果显示毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的回收率分别为100.57%、101.76%、99.82%、98.55%；RSD分别为1.22%、1.18%、0.95%、1.39%。

2.5 样品含量测定 通过对24批密蒙花药材进行色谱分析，测定密蒙花样品中毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素含量，含量测定结果见表2。由表2可以看出，4个产地密蒙花中毛蕊花糖苷、蒙花苷、芹菜素、木犀草素含量比较，差异均有统计学意义(毛蕊花糖苷：F(3，20)=19.748，P=0.000；蒙花苷：F(3，20)=13.708，P=0.000；芹菜素：F(3，20)=61.693，P=0.000；木犀草素：F(3，20)=10.991，P=0.000)。其中，湖北五峰县毛蕊花糖苷和蒙花苷的含量最高；陕西旬阳县芹菜素含量最高，木犀草素含量最低；四川金堂县木犀草素含量最高，芹菜素含量最低；云南姚安县毛蕊花糖苷和蒙花苷的含量都较低。

2.6 主成分分析(principal component analysis，PCA) 将24批次密蒙花样品数据导入SIMCA 14.1软件中，进行PCA研究，见表3。前2个主成分的特征值均大于1，其中第1主成分(PC1)特征值为2.718，方差贡献率为54.461%；第2主成分(PC2)特征值为1.320，方差贡献率为33.009%，累积贡献率达到87.470%。结果说明前2个因子在反映4种不同产地密蒙花与4个成分的相互关系中起主导作用，能够评价不同产地密蒙花的品质。PC1主要反映来自蒙花苷(0.598)的信息；PC2主要反映来自毛蕊花糖苷(0.693)的信息。

表2 不同产地密蒙花中4种成分含量比较

表3 主成分矩阵

上述结果表明，通过PCA降维处理后所提取的主成分能够代表密蒙花4个成分的主要信息。根据24批密蒙花样品的PCA结果，提取前2个主成分作得分图，见图2。由图2可知，4个产地的药材在主成分空间的分布上有各自的特定区域，湖北五峰县与陕西旬阳县密蒙花较接近，云南姚安县与四川金堂县密蒙花较接近，可能是由于受地理、气候等因素影响，其化学成分的富集也有所不同。

图2 24批样品PCA得分图

图3 4个化学成分对药材分组的VIP 值

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本实验采用光二极管阵列检测器进行全波长扫描，考察不同吸收波长下各待测成分的图谱响应强度，发现毛蕊花糖苷在330 nm波长处紫外吸收较大，蒙花苷的最大紫外吸收为333 nm，木犀草素的最大紫外吸收为350 nm，芹菜素的最大紫外吸收为338 nm，4种活性成分在330 nm波长时均有较强的紫外吸收，故最终确定330 nm为本研究4种活性成分含量测定的检测波长。

3.2 色谱条件的选择 本研究选用4个不同系统的流动相：乙腈-0.1%磷酸、乙腈-1%冰醋酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-1%冰醋酸进行测定，同时考察了各系统不同组成比例的流动相对色谱分离效果的影响。结果表明，当以乙腈-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱时，各个指标成分出峰时间适中，各成分间分离度良好，故确定以此为最终的流动相。

3.3 不同产地密蒙花药材中4种成分含量的差异 密蒙花作为一种常用眼科中药，其药材的质量直接影响到制剂的质量与疗效，而不同产地的药材质量差异往往较大，因此评价不同产地密蒙花药材质量，优选产地也是保证密蒙花相关制剂质量的重要手段之一。PCA和PLS-DA结果显示，不同产地药材样品中4种化学成分的含量具有较大差异，湖北五峰县密蒙花中毛蕊花糖苷和蒙花苷含量较高，陕西旬阳县密蒙花中芹菜素含量较高，四川金堂县密蒙花中木犀草素含量较高，芹菜素含量较低。VIP分析筛选出毛蕊花糖苷和芹菜素为分类标志物，这2个化学成分可有效区分不同产地密蒙花样品，即湖北五峰县密蒙花中毛蕊花糖苷和芹菜素的含量分别为24.25～27.46 mg/g、0.43～0.57 mg/g，云南姚安县密蒙花中毛蕊花糖苷和芹菜素的含量分别为12.45～19.44 mg/g、0.35～0.49 mg/g，陕西旬阳县密蒙花中毛蕊花糖苷和芹菜素的含量分别为3.81～20.22 mg/g、0.58～0.78 mg/g，四川金堂县密蒙花中毛蕊花糖苷和芹菜素的含量分别为13.98～23.49 mg/g、0.25～0.34 mg/g。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于密蒙花药材中4种成分含量的同时测定；不同产地的密蒙花药材质量差异较大。