心理应激对雌性小鼠胃泌素、雌激素及其胃食管炎症因子的影响

阿孜古丽·阿力木江 买买提·依斯热依力 王婧 艾克拜尔·艾力 陆萍克力木·阿不都热依木

前 言

胃食管反流病（gastroesophageal reflux diseases，GERD）是一种临床实践中常见的慢性上消化道疾病，其发病率逐年增高［1］。导致GERD的因素较多，如老龄化、自身免疫、焦虑、抑郁及生活方式等均可引起该疾病，但其发病机制尚未明确。据报道，焦虑抑郁状态及各种心理应激均与GERD的发生密切相关［2］。研究结果表明，女性GERD患者异常的酸反流和食管运动功能障碍均与胃泌素和雌激素水平变化有关［3］。此外，氧化应激和炎症因子在GERD发生与发中的作用逐渐受到重视［4］。本研究通过建立心理应激雌性小鼠模型，分析心理应激对雌性小鼠胃泌素及雌激素水平的影响，探讨其对氧化应激和食管炎症发生中的作用。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：20只8周龄，SPF级雌性昆明小鼠，购于新疆实验动物研究中心［SCXK（新）2011‐0001］，饲养于新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所IVC系统动物中心。采用Microsoft office excel软件随机分心理应激组和正常对照组，每组各10只。两组小鼠单只饲养在自由进食水的鼠笼内，每日给予12h/12h昼夜循环，光照均始于8∶30，止于20∶30。

2.主要试剂与仪器：自制式束缚器和1‐14K型低温高速离心机（美国Sigma公司生产）；Eclipse E200型光学显微镜（日本尼康公司生产）；C1000型梯度PCR扩增仪（美国Bio‐Rad公司生产）；PBS缓冲液粉末、柠檬酸及H&E染色相关试剂均购于北京中杉金桥公司；TRIzol试剂（美国Invitrogen公司生产）；cDNA合成试剂盒（北京天根有限公司生产）；实时定量RT‐PCR试剂盒（日本TaKaRa公司生产）。

二、慢性束缚应激动物模型的建立

束缚应激施行时间均在每日上午10∶30～12∶30进行，每日限制活动2 h，期间禁食禁水，后放回鼠笼内自由活动，连续束缚应激14 d［5］。10只心理应激组小鼠置于用50 ml离心管所制的自制式束缚器中（离心管提前烫制出直径约5 mm的通气孔若干，分布于左右及上侧管壁）。正常对照组小鼠自由饮水摄食，其余时间两组小鼠处理相同。

三、取材与标本处理

心理应激第14天17∶00开始对各组小鼠禁食，于次日11∶00腹腔内注射戊巴比妥钠，150毫克/千克进行麻醉并取材。麻醉的小鼠以平卧位固定，从腹部正中至剑突取切口3 cm切口，下腔静脉取血注入于1.5 ml EP管中，全段食管组织剪断取材。

四、组织病理学处理及炎症评价

两组小鼠食管组织置于4%中性甲醛固定24 h后水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋，制成5 μm厚切片行H&E染色，并观察分析两组食管组织形态学改变并进行炎症评价［6］。

五、酶联免疫吸附法

实验结束当天取每组小鼠全血标本，放入含有15 g/L乙二胺四乙酸的采血管内，血液标本在采集后的30 min内于4℃、3000×g离心10 min，取上清，并置于−80℃冰箱中保存。采用酶联免疫吸附法检测血清胃泌素、雌二醇等激素的含量以及NADPH 氧化酶‐4（NADPH oxidase，Nox‐4）、白介 素 ‐1β （Interleukin‐1β， IL‐1β）、 白 介 素 ‐6（Interleukin‐6，IL‐6）以及肿瘤坏死因子‐α（Tumor necrosis factor‐α，TNF‐α）等的含量。实验过程及测量指标浓度的计算严格按试剂盒说明书进行。

六、实时定量RT‐PCR

采用实时定量RT‐PCR方法检测Nox‐4、IL‐1β、IL‐8及TNF‐α等指标的mRNA的相对表达。取两组每只小鼠食管组织40 mg，采用TRIzol试剂提取总RNA，采用天根公司Fast Quant RT试剂盒合成第一链cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成引物，各指标及β‐肌动蛋白（actin）引物序列和扩增产物长度见表1。实时定量RT‐PCR，反应体系为 20 μl，按照 94 ℃ 3 min，95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，共40循环设置反应条件。反应结束后由电脑自动得出荧光曲线及Ct值，采用2—△△Ct计算出目标基因的相对表达倍数。

表1 实时定量RT‐PCR引物序列及产物长度

七、统计学分析方法

采用SPSS22.0软件处理数据。符合正态分布的计量资料均以（±s）表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、心理应激对激素水平的影响

酶联免疫吸附（ELISA）实验结果显示，14d的束缚应激后，小鼠血液中胃泌素（图1A）和雌二醇（图1B）激素水平显著降低，较对照组比较，两者的差异有统计学意义（t=4.265，5.622；P＜0.05）。

图1 两组小鼠血清激素水平比较（每组n=10，aP＜0.05 vs正常组）

二、心理应激对食管组织的影响

心理应激组小食管粘膜层可见基底细胞增生，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及浆细胞浸润反应和炎症性改变，提示食管上皮受到外界因素损伤后的表现及增生修复反应（图2A）。心理应激组小鼠食管粘膜炎症细胞评分明显高于对照组（图2B），两组比较的差异有统计学意义（t=7.512，P＜0.05）。

图2 两组食管粘膜组织H&E染色

三、心理应激引起氧化应激水平上升

RT‐PCR和酶联免疫吸附（ELISA）实验结果显示，心理应激组小鼠食管粘膜组织NADPH氧化酶‐4（NADPH oxidase，Nox‐4）的mRNA相对表达（图3A）及其血液中（图3B）的表达水平显著上升，与对照组相比，差异有统计学意义（t=5.546，6.013；P＜0.05）。

图3 两组食管组织Nox‐4的表达水平比较（n=10，aP＜0.05 vs正常组）

四、慢性束缚应激引起炎症因子表达上升

心理应激组食管粘膜组织IL‐1β、IL‐6及TNF‐α的mRNA转录水平显著高于对照组（图4），两组比较的差异有统计学意义（t=7.124，5.876，6.832；P＜0.05）。酶联免疫吸附结果显示，血液中心理应激组炎症因子IL‐1β、IL‐6、TNF‐α的释放水平明显上升（图5），与对照组相比差异有统计学意义（t=2.317，4.681，8.105；P＜0.05）。

图4 两组食管组织炎症因子mRNA表达水平的比较（n=10，aP＜0.05 vs正常组）

图5 两组血清炎症因子水平比较（n=10，aP＜0.05 vs正常组）

讨 论

CERD的病理生理机制有多种因素参与，包括遗传、环境、解剖、激素、神经因素等，但其详细机制目前尚不清楚。胃食管反流是一种生理现象，只有出现反流症状或并发症时才称作反流性疾病［7］。胃酸是食管黏膜的主要损伤因素。食管黏膜与酸接触后，局部血流和组织内胃泌素分泌异常，从而黏膜对酸的易感性增强。反复的酸刺激使黏膜发生炎症，最终导致食管炎。食管内酸化会影响吞咽频率、食管黏膜完整性和食管原发性蠕动［8］。研究发现，胃泌素与GERD的发生机制密切相关，胃泌素分泌不足可以导致下食管括约肌（Lower esophageal sphincter，LES）功能不全，进而增加GERD发病风险。因此，若血清胃泌素水平较低，可以初步提示GERD，特别是内镜阳性的反流性食管炎［9］。但由于各研究纳入的病例组不同，特别是NERD是否纳入，血清对GERD诊断界限值和诊断效能参差不齐。

从食管的解剖学来看食管下段完全由平滑肌构成，GERD患者的食管动力学改变特点与食管平滑肌的分布特点和平滑肌的收缩功能密切相关［10］。胃泌素是一种重要的胃肠激素，它主要由G细胞分泌，具有刺激胃酸分泌、促进胃肠道细胞增殖和分化等生理功能。体内胃泌素分泌水平主要受G细胞数量、胃内pH值、刺激迷走神经、胃窦牵拉、服用抑酸药和促胃泌素激素药物等诸多因素影响。胃泌素可以维持食管下括约肌压力，防止胃食管反流。研究结果表明，胃泌素通过结合LES平滑肌上的CCK‐2受体，促进LES的收缩，促进食管平滑肌推进性蠕动，从而防止酸反流［11］。胃泌素不全或水平降低是引起LES功能不全的重要因素。Suzuki等［12］发现，GERD患者血液中胃泌素水平及LES收缩能力显著低于健康对照组。血清胃泌素低值是胃食管反流病的预测指标其原理可以概括为两点。其一，低胃泌素血症是GERD发生机制之一。其二，GERD是一种酸相关性疾病，多数患者处于高胃酸状态，基础胃酸分泌量较高；由于胃酸的反馈性抑制作用，胃窦G细胞分泌胃泌素减少，血清胃泌素相应降低。既然GERD是一种酸相关性、动力障碍性疾病，因此胃泌素与其发病机制关系密切，为临床诊断提供一种可能。因此，胃泌素分泌异常可能是GERD发生的机制之一。此外，绝经后老年妇女因卵巢萎缩，血清雌二醇含量减低，导致食管胃粘膜屏障功能削弱，粘液分泌减少，微循环障碍，对胃酸反流、胆汁酸和外源性刺激敏感性增强，进而引起GERD的发生［13］。对老年女性GERD防治，除使用促动力剂、抑酸剂外加用雌激素补充疗法可望改善症状，提高疗效。Naik等［14］的研究结果表明，雌、孕激素对LES压力具有松弛效应，在妊娠期女性中可引起LES功能降低，而出现GERD相关症状的加重。

过量产生的氧化应激和炎症反应在GERD发生与发展中的作用逐渐受到重视。氧化应激‐炎症‐衰老，三者的形成机制互为因果关系；当机体氧化、抗氧化能力出现紊乱时，可使炎症反应和促炎症因子的大量释放，最终导致机体持续处在过度炎症状态［15］。炎性细胞因子在GERD发生中的作用逐渐成为学者们关注的焦点。氧化应激是由活性氧过量生成或细胞内抗氧化防御系统受损导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对机体造成损害的病理状态［16］。既往研究显示，心理应激反应是诱导活性氧过量产生的的重要机制，在GERD的进程中发挥着重要作用［17‐19］。近年来，焦虑、抑郁等精神心理异常因素常发现与下丘脑‐垂体‐卵巢轴的神经内分泌功能失调，性激素（雌二醇、促黄体生成素）分泌异常、排卵功能障碍等有关［20‐21］。本研究发现，与对照组比较，心理应激小鼠血液中胃泌素、雌二醇等激素水平更低；食管粘膜组织炎症评分更高；氧化应激和炎症因子水平增高，这结果提示心理应激诱导激素水平的异常分泌，促进食管氧化应激和炎症损伤。

综上所述，胃泌素以及雌二醇与GERD的发生机制密切相关。心理应激增加罹患GERD的风险，会导致GERD症状的加重。本研究结果显示，心理应激诱导雌性小鼠胃泌素和雌二醇水平降低，促进食管氧化应激产生及其炎症发生，可能是心理压力相关GERD的发病机制之一，但其分子机制仍有待进一步探索。