抗癌烷化剂三溴基丙酮酸对秀丽隐杆线虫衰老指标及寿命的影响

魏倩囡 王素娟 刘佳奇

[摘要]目的 探討不同浓度的三溴基丙酮酸（3-BrPA）对秀丽隐杆线虫寿命的作用以及相关衰老指标的测试，系统评估其对生命状态的影响。方法 选取同期化的秀丽隐杆线虫作为实验对象，选择3.125、6.250、12.500、25.000 mmol/L的3-BrPA作为实验组，0.000 mmol/L作为对照组。线虫寿命实验中，每个浓度均选择135条线虫，记录并绘制各个实验组和对照组的生存曲线;线虫吞咽能力实验每组均选择10条线虫，记录并绘制反映线虫衰老程度的吞咽速率图。结果 秀丽隐杆线虫的寿命实验和吞咽能力实验结果均显示，3.125、25.000 mmol/L实验组低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;而6.250、12.500 mmol/L实验组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 3.125、25.000 mmol/L浓度的3-BrPA对秀丽隐杆线虫显示一定程度的损伤;而6.250、12.500 mmol/L浓度的3-BrPA对秀丽隐杆线虫并没有显示明显的毒副作用，且与对照组线虫相比，其线虫寿命并未缩短。产生此特殊现象或许和秀丽隐杆线虫体内丙酮酸浓度及饮食限制（DR）机制有关，具体原因仍在进一步研究。

[关键词]抗癌烷化剂;三溴基丙酮酸;秀丽隐杆线虫;抗衰老;毒副作用

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）6（b）-0004-04

[Abstract] Objective To explores the influence of different concentrations of 3-Bromopyruvate （3-BrPA） on the lifespan of Caenorhabditis elegans and tests of related aging indicators to systematically assess its impact on life conditions. Methods The same period of Caenorhabditis elegans was selected as the experimental object， 3-BrPA of 3.125， 6.250， 12.500 and 25.000 mmol/L were selected as the experimental group， and 0.000 mmol/L were selected as the control group. A total of 135 cases of Caenorhabditis elegans were selected for each concentration in the nematode life test group， and the survival curves of the each experimental group and the control group were recorded and plotted in the nematode swallowing capacity experiment， 10 cases of Caenorhabditis elegans were selected in the each group， and the swallowing rate graph reflecting the aging degree of the Caenorhabditis elegans was recorded and plotted. Results Both Caenorhabditis elegans lifespan test and pharynx pumping ability test results showed that which in the experimental group of 3-BrPA of 3.125， 25.000 mmol/L were lower than those of the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. There were no significant differences in the Caenorhabditis elegans lifespan test and pharynx pumping ability test results between the the experimental group of 3-BrPA of 6.250， 12.500 mmol/L and the control group （P>0.05）. Conclusion 3-BrPA at 3.125 and 25.000 mmol/L showed a certain degree of damage to Caenorhabditis elegans; However， 3-BrPA at the concentrations of 6.250 and 12.500 mmol/L aren′t show significant toxic and side effect on Caenorhabditis elegans， and compared with the control group， the lifespan of the Caenorhabditis elegans is not shortened and prolonged. The occurrence of this special phenomenon may be related to the pyruvate concentration in the body of Caenorhabditis elegans and the mechanism of dietary restriction （DR）. The specific reasons are still being further studied.

[Key words] Anticancer alkylating; Agent 3-Bromopyruvate; Caenorhabditis elegans; Anti-aging; Toxic side effect

随着全球癌症发生率和死亡率的逐年提高，癌症已经成为人类死亡的重要原因之一[1]。在众多抗癌药物中，烷化剂是最早应用于癌症治疗的药物，也是目前被广泛应用于肿瘤化学治疗的常规药物。在长期临床实践中发现，单功能烷化剂普遍存在治疗效率较低、毒副作用强等缺陷，很难达到理想的化疗效果[3]。近年来，三溴基丙酮酸（3-BrPA）作为新一代高效低毒烷化剂，通过抑制肿瘤细胞糖酵解过程中的己糖激酶Ⅱ（HK2）和甘油醛-3-脱氢酶（GAPDH），协作诱导细胞内ATP耗竭，从而导致肿瘤细胞凋亡[4-5]。同时，其抑制了琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性，导致细胞内氧化还原状态失衡[6]。3-BrPA因其细胞毒性小，作用范围广，对多种肿瘤细胞敏感，因而被认为是目前临床上最有前途的抗癌烷化剂[7]，而目前关于3-BrPA对生命体生存状态（寿命）的系统评估尚未见深入报道。

秀丽隐杆线虫是衰老研究的经典模式生物，具有相对短的寿命（在20℃下2～3周）、保守的发育模式、遗传操作容易、测序完全的基因组几个显著特点，且其蛋白质序列中约有83%与人类同源[8]，同时有着极为丰富的遗传学和发育生物学研究背景，是研究毒理学或人类疾病的良好生物模型[9-10]。所以本研究选择秀丽隐杆线虫作为模型生物，以评估不同浓度的3-BrPA对秀丽隐杆线虫生存状态的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1线虫株和菌株  本实验所选秀丽隐杆线虫野生型N2和大肠杆菌OP50均由美国国家卫生研究院衰老研究所提供。

1.1.2试剂与仪器  3-BrPA、5-氟尿苷（5-fluoro-2′-deoxyuridine，FUDR）购自Sigma Aldrich有限公司，氯化钠（分析纯）、无水氯化钙（分析纯）、无水硫酸镁（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、N，N-二甲基甲酰胺（分析纯）、磷酸氢二钾（分析纯）、叠氮钠、制霉菌素、琼脂粉、LB营养琼脂购自国药集团化学试剂有限公司;蛋白胨购自BD公司。体视显微镜SZ61型购自日本奥林巴斯（OLYMPUS）公司;超净工作台为新加坡ESCO实验室仪器设备;生化培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1基础配方  ①NGM固体培养基：NaCl 3 g、琼脂粉18 g、胰蛋白胨2.5 g加入975 ml蒸馏水，121℃灭菌20 min，冷却至60℃左右，无菌条件下加入1 ml的5 mg/ml胆固醇乙醇溶液、1 ml的1 mol/L CaCl2、1 ml的1 mol/L MgSO4、0.67 ml 200 mg/ml硫酸链霉素溶液、0.17 ml的40 mg/ml制霉菌素DMF溶液和25 ml的1 mol/L pH 6.0的磷酸钾缓冲液。混合均匀后铺培养皿，冷却备用。②S-basal缓冲液：NaCl 5.85 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 6 g加蒸馏水至1 L，高压灭菌备用。③LB液体培养基：LB肉汤10 g加入蒸馏水至500 ml，121℃高压灭菌20 min。④LB固体培养基：LB营养琼脂16 g加入蒸餾水至500 ml，121℃高压灭菌20 min，冷却至60℃时，加入200 mg/ml硫酸链霉素溶液0.33 ml。

1.2.2菌株培养  从-80℃冰箱中取出大肠杆菌OP50，用灭菌后的牙签钝端轻轻蘸取OP50，点在LB固体培养基上，用接种环在LB固体培养基上涂布OP50，涂布多个位置，然后将涂布后的LB培养基放置37℃恒温箱培养15 h。次日用接种环选取LB培养基上的单个菌株，涂在LB液体培养基的瓶口处，轻轻摇晃培养瓶，让菌株均匀，之后置于37℃恒温箱培养8～10 h。将培养后的OP50菌液滴加在提前制备好的NGM培养基上，置于超净工作台中生长至实验所需的厚度。

1.2.3线虫一般培养及同期化  N2：选取性成熟的成虫15条，挑入至食物充足无污染的NGM培养基。将培养基放在25℃恒温箱培养5 h，剔除成虫后转移到15℃恒温箱继续培养，直至卵生长到L4期;之后将L4期线虫挑入新的加入FUDR和不同浓度3-BrPA的食物充足的NGM培养基上，此时线虫记为Adult 0 d龄，然后将NGM培养基放在25℃恒温箱96 h，再转移到20℃恒温箱继续培养。

1.2.4线虫寿命实验  选取同期化培养的野生型N2线虫进行寿命实验，实验中梯度给药，梯度给药浓度为0.000、3.125、6.250、12.500和25.000 mmol/L，共5个梯度，0.000 mmol/L为对照组，其余为实验组，每组均选取135条线虫。浓度选择参照前期预实验结果，从最高浓度100.000 mmol/L以2倍递减至最小浓度3.125 mmol/L，预实验结果显示选择50.000、100.000 mmol/L时，线虫会在12～15 d或更短时间内大批量死亡，不具有实验入组的价值。所有实验均重复3次，结果取平均值。

1.2.5线虫吞咽能力实验  选取同期化培养的野生型N2线虫给药时间的第5天和第10天进行吞咽能力实验，实验中梯度给药，梯度给药浓度为0.000、3.125、6.250、12.500、25.000 mmol/L，共5个梯度，0.000 mmol/L为对照组，其余为实验组，每组均选取10条线虫。计时1 min，500倍显微镜下记录线虫咽部的吞咽次数，实验重复3次，结果取平均值。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组样本均数的两两比较采用ANOVA分析（方差齐时，采用LSD-t检验，方差不齐时，采用Games-Howell法），以P<0.05为差异有统计学意义。

2結果

2.1 lifespan的结果

3.125、25.000 mmol/L实验组和对照组比较，实验组线虫寿命缩短，差异有统计学意义（P<0.05）;6.250、12.500 mmol/L实验组和对照组比较，实验组线虫寿命并无缩短，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。3-BrPA给药浓度为0.000、3.125、6.250、12.500、25.000 mmol/L时秀丽隐杆线虫寿命曲线见图1（封三）。

2.2 3-BrPA对秀丽隐杆线虫吞咽能力的影响

在给药的第5天和第10天测试线虫的吞咽速率，结果显示3.125和25.000 mmol/L的实验组线虫低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;6.250、12.500 mmol/L实验组线虫与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

3讨论

Wood等[11]发现，在大肠杆菌OP50中加入抗生素会影响线虫寿命，为避免3-BrPA药物自身抗菌性会影响寿命实验结果，因此在实验组和对照组均加入2 mmol/L的卡那霉素。线虫寿命实验结果显示，3-BrPA的给药浓度为3.125 mmol/L或25.000 mmol/L时，线虫寿命缩短，提示药物自身毒性会损伤线虫寿命。3-BrPA的给药浓度在6.250、12.500 mmol/L时，线虫寿命并未缩短，提示在特定浓度线虫寿命并不受药物损伤。

线虫吞咽能力实验是线虫抗衰老实验的一种，正常生理状况下，线虫的吞咽速率反映线虫进食的能力，进而间接反映线虫的衰老程度。线虫吞咽能力结果显示，与对照组比较，3-BrPA的给药浓度为3.125 mmol/L或25.000 mmol/L时，线虫吞咽速率下降，衰老加速;而当3-BrPA的给药浓度在6.250、12.500 mmol/L时，线虫的吞咽速率无明显变化，衰老无明显加速。线虫吞咽能力实验结果与寿命实验结果一致。

3-BrPA在3.125 mmol/L或25.000 mmol/L浓度时，线虫寿命缩短，其加速衰老的机制可能与抗肿瘤的机制一致。3-BrPA通过抑制糖酵解过程的酵解酶阻止细胞得到能量，从而诱导肿瘤细胞凋亡。3-BrPA的抗肿瘤作用在体内外均被证实[12-14]，最新研究显示，3-BrPA可以抑制多种肿瘤的恶性发展[15-17]。3-BrPA在6.250、12.5000 mmol/L浓度时，线虫寿命并不受影响，衰老并未加速，与抗肿瘤机制及此前的毒性实验结果不一致，此特殊现象或许与丙酮酸水平及饮食限制（DR）有关。

Mouchiroud等[19]的实验显示，丙酮酸稳态在秀丽隐杆线虫的寿命控制中起着核心作用，丙酮酸增多可以在一定程度上延长秀丽隐杆线虫的寿命。因此，除了高浓度的3-BrPA自身的毒性会导致秀丽隐杆线虫寿命缩短外（付喜梅[18]等的研究认为，高浓度的3-BrPA对线虫具有毒性作用，低浓度的3-BrPA能抑制秀丽隐杆线虫幼虫发育），3-BrPA引起的丙酮酸减少可能是导致秀丽隐杆线虫寿命缩短的其中一个原因。DR是延长寿命的重要干预措施，即减少热量摄入而无营养不良[20]。Maeda等[21-23]的研究显示，DR不仅可以延长寿命，而且可以延缓与年龄有关的疾病如癌症的发生，而3-BrPA引起的细胞内ATP摄入减少，类似于DR的状态。在特定的浓度下，3-BrPA可能通过丙酮酸模拟DR状态作用于某个特定的基因，最终导致在特殊浓度范围内秀丽隐杆线虫的寿命无损伤，具体机制目前尚无法确定。

对于此种现象涉及的3-BrPA的具体作用机制，接下来将会进一步加大实验的样本量，并深入测试与丙酮酸相关基因及上下游调节机制，以期对糖代谢及衰老与长寿等研究领域发现新的机制，并对进一步开发新的抗肿瘤药物提供启示性线索。

[参考文献]

[1]中国肿瘤临床与康复编辑部.2017年中国最新癌症数据[J].中国肿瘤临床与康复，2017，24（6）：760.

[2]葛瑶，任婷，崔鑫，等.新型多功能抗癌烷化剂研究进展[J].化学试剂，2018，40（8）：707-713，720.

[3]Chen TC，Yu J，Nouri Nigjeh E，et al.A perillyl alcohol-conjugated analog of 3-bromopyruvate without cellular uptake dependency on monocarboxylate transporter 1 and with activity in 3-BP-resistant tumor cells[J].Cancer Lett，2017， 400：161-174.

[4]Yadav S，Pandey SK，Kumar A，et al.Singh antitumor and chemosensitizing action of 3-bromopyruvate：implication of deregulated metabolism[J].Chem Biol Interact，2017，270：73-89.

[5]Sheng Y，Jiang Q，Dong X，et al.3-Bromopyruvate inhibits the malignant phenotype of malignantly transformed macro-phages and dendritic cells induced by glioma stem cells in the glioma microenvironment[J].Biomed Pharmacother，2020， 121：109610.

[6]Xian SL，Cao W，Zhang XD，et al.3-Bromopyruvate inhibits human gastric cancer tumor growth in nude mice via the inhibition of glycolysis[J].Oncol Lett，2015，9（2）：739-744.

[7]Huang RT，Huang Q，Wu GL，et al.Evaluation of the antioxidant property and effects in Caenorhabditis elegans of Xiangxi flavor vinegar，a hunan local traditional vinegar[J].Zhejiang Univ Sci B，2017，18（4）：324-333.

[8]García-Espineira MC，Tejeda-Benítez LP，Olivero-Verbel J.Toxic effects of bisphenol A，propyl paraben，and triclosan on Caenorhabditis elegans[J].Int J Environ Res Public Health，2018，15（4）：684.

[9]Gu QL，Zhang Y，Fu XM，et al.Toxicity and metabolism of 3-bromopyruvate in Caenorhabditis elegans[J].J Zhejiang Univ Sci B，2020，21（1）：77-86.

[10]Yadav S，Pandey SK，Goel Y，et al.Diverse stakeholders of tumor metabolism：an appraisal of the emerging approach of multifaceted metabolic targeting by 3-bromopyruvate[J].Front Pharmacol，2019，10：728.

[11]Wood JG，Rogina B，Lavu S，et al.Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans[J].Nature，2004，430（7000）：686-689.

[12]Pichla M，Sroka J，Pienkowska N，et al.Metastatic prostate cancer cells are highly sensitive to 3-bromopyruvic acid[J].Life Sci，2019，227：212-223.

[13]Cho EJ，Yu SJ，Kim K，et al.Carbonic anhydrase-Ⅸ inhibition enhances the efficacy of hexokinase Ⅱ inhibitor for hepatocellular carcinoma in a murine model[J].J Bioenerg Biomembr，2019，51（2）：121-129.

[14]Yamada M，Kagaya M，Noguchi N，et al.Topical 3-bromopyruvate is a novel targeted therapy for melanoma in a preclinical model[J].J Dermatol Sci，2018，92（2）：134-142.

[15]Yoo JJ，Yu SJ，Na J，et al.Hexokinase-Ⅱ inhibition synergistically augments the anti-tumor efficacy of sorafenib in hepatocellular carcinoma[J].Int J Mol Sci，2019，20（6）：1292.

[16]Ishiguro Y，Kobayashi M，Ideno M，et al.Valproate sensitizes human glioblastoma cells to 3-bromopyruvate-induced cytotoxicity[J].Int J Pharm，2018，551（1-2）：97-102.

[17]Chiasserini D，Davidescu M，Orvietani PL，et al.3-Bromopyruvate treatment induces alterations of metabolic and stress-related pathways in glioblastoma cells[J].J Proteomics，2017，152：329-338.

[18]付喜梅.3-溴丙酮酸對秀丽隐杆线虫毒性和代谢的研究[D].兰州：兰州大学，2016.

[19]Mouchiroud L，Molin L，Kasturi P，et al.Pyruvate imbalance mediates metabolic reprogramming and mimics lifespan extension by dietary restriction in Caenorhabditis elegans[J].Aging Cell，2011，10（1）：39-54.

[20]Masoro EJ.Overview of caloric restriction and ageing[J].Mech Ageing Dev，2005，126（9）：913-922.

[21]Maeda H，Gleiser CA，Masoro EJ，et al.Nutritional inflfluences on aging of Fischer 344 rats：Ⅱ.Pathology[J].J Gerontol，1985，40（6）：671-688.

[22]Lane MA，Ingram DK，Roth GS.Calorie restriction in nonhuman primates：effects on diabetes and cardiovascular disease risk[J].Toxicol Sci，1999，52（2）：41-48.

[23]Mattson MP，Wan R.Benefificial effects of intermittent fasting and caloric restriction on the cardiovascular and cerebrovascular systems[J].Nutr Biochem，2005，16（3）：129-137.

（收稿日期：2020-01-13  本文编辑：祁海文）