杧果炭疽病菌漆酶基因Cglac3序列特征及其在两个侵染相关基因突变体中的表达分析

钟昌开 肖春丽 张贺 蒲金基 吴秋玉 刘燕莉 刘晓妹

摘  要：本研究運用同源克隆技术克隆了杧果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的Cglac3漆酶基因，并采用实时荧光定量PCR分析了该基因在侵染过程、漆酶基因LAC1突变体、外切葡聚糖酶基因CgCBH1突变体中的差异表达情况。结果表明，杧果炭疽病菌漆酶Cglac3基因大小为1842 bp，含3个内含子，大小分别为56、51、58 bp。Cglac3开放读码框编码558个氨基酸，蛋白分子量为61.38 kDa，等电点（PI）为4.50。与未侵染对照0 h的表达量相比，Cglac3在6 h孢子萌发形成附着胞时表达量迅速升高，在12 h侵入寄主后达到最高，之后在菌丝扩展、叶片显症过程中出现波动，但均远高于0 h的表达量，显示Cglac3在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用，可能是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。与野生型相比，Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1敲除突变体中下降了74%，在外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除突变体中下降了56%;在CgCBH1缺失敲除突变体中，LAC1的表达下降了68%，与Cglac3的表现趋势一致，说明Cglac3的表达受LAC1调控，外切葡聚糖酶基因CgCBH1也会影响Cglac3和LAC1的表达。

关键词：杧果;漆酶;Cglac3基因;qRT-PCR中图分类号：S432;Q78      文献标识码：A

Sequence Characteristics of Laccase GeneCglac3 and Its Expression in Two Infection-Related Gene Mutants fromColletotrichum

gloeosporioides on Mango

ZHONG Changkai¹， XIAO Chunli¹， ZHANG He²， PU Jinji²， WU Qiuyu¹， LIU Yanli¹， LIU Xiaomei^1*

1. College of Plant Protection， Hainan University / Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests （Hainan University）， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： In this experiment， a laccase geneCglac3was cloned  by homologously fromColletotrichumgloeosporioides， which is the fungal pathogen of mango anthracnose， and its expressions during infection process， in laccase gene Cglac1and exoglucanase gene CgCBH1deletion knockout mutants， were comparatively analyzed using real-time fluorescent quantitative PCR.Cglac3was 1842 bp in size with three introns of 56， 51 and 58 bp respectively. The open reading frame ofCglac3encoded 558 amino acids with a protein molecular weight of 61.38 kDa and an isoelectric point （PI） of 4.50.Cglac3was highly expressed at 6 h after inoculation when the fungal spores were germing and forming appressoria， increased rapidly at 12 h after inoculation when the fugus were invading. Since then， the expresson ofCglac3fluctuated during hyphal expansion and leaf necrosis， but both were much higher than the expression level at 0 h. It suggested that Cglac3played an important role duringC. gloeosporioidesinfection， might be a key virulent factor. Compared with the wild type， the expression ofCglac3decreased by 74% in theC. gloeosporioidesΔLAC1mutant， and decreased by 56% in theΔCgCBH1mutant. Interestingly， the expression ofLAC1was also decreased by 68% in theΔCgCBH1mutant， consistent with the trend ofCglac3expression， indicating thatLAC1 affected the expression ofCglac3， andCgCBH1affected both the expressions ofCglac3 andLAC1.

Keywords： mango; laccase;Cglac3gene; qRT-PCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.019

原产于“一带一路”沿线南亚、东南亚等国家的杧果（Mangifera indicaL.）有着“热带果王”的美誉，近年来我国杧果产业得到了长足发展，已成为热区重要的特色农业支柱产业之一，面积和产量分别位居世界第3位和第5位，但在品种选育、栽培管理、病虫害防治、采后保鲜加工等方面与上述原产国仍存在一定差距^[1]。

由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeos?porioi?desPenz. & Sacc.）引起的杧果炭疽病是影响该产业健康发展的主要因素之一，该菌在细胞壁水解酶的协助下，主要借助芽管顶端产生的黑色素化的附着胞直接穿透寄主表皮侵入为害^[2]。

漆酶是多铜氧化酶，在黑色素合成途径中起着重要作用。常以基因家族的形式广泛存在于植物病原菌，成员几个至十余个不等^[3-4]。来自同一病原菌漆酶家族中不同成员的蛋白序列并不具有较强的保守性，功能差异较大。目前得到较为系统研究的是玉米大斑病菌（Setosphaeria tur?cica）漆酶基因家族，发现了9个漆酶成员StLAC1～StLAC9，其中StLAC1、StLAC4、StLAC6属于漆酶亚家族1，StLAC2属于漆酶亚家族3^[5-6]。StLAC1和StLAC2基因在黑色素合成、附着胞穿透力和分生孢子形成等方面具有重要作用^[7]。StLAC1突变后黑色素合成受阻，菌落呈灰白色，生长速率减慢，不产生分生孢子，菌丝透明呈不规则状，菌丝末端能形成附着胞，但因膨压下降、侵染能力显著降低、渗透调节能力增强，漆酶、纤维素酶和果胶酶活性显著下降^[8];与StLAC1不同之处，StLAC2突变后菌丝在玻璃纸上不能发育产生附着胞，长出的新菌丝只能在玻璃纸膜表面蔓延，不能穿透玻璃纸膜，无法侵入完整的玉米叶片，但能侵染刺伤的玉米叶片^[9];在突变体ΔStLAC1中，StLAC1完全不表达，其他黑色素合成酶基因表达量与野生型无明显差异，而StLAC2表达量有所上调，起到了互补StLAC1的作用^[5]。相反，番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.Lyco?persici）的3个漆酶成员（lcc1、lcc3和lcc5）的缺失突变体对致病力均无影响，lcc1仅与氧化胁迫能力及漆酶酶活相关，lcc3仅与菌落生长速率、碳源利用、氧化胁迫以及对酚化合物的敏感性相关^[10-11]。更有甚者，大丽轮枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）的漆酶基因VdLac对菌株的营养生长、产孢、致病力以及黑色素合成均不影响^[12]。

前期研究從杧果炭疽病菌中搜索到了12个漆酶基因。漆酶基因LAC1调控分生孢子的产生、菌丝生长、发育、黑色素沉着、环境的适应性;也调控漆酶和细胞壁降解酶的产生，突变后不能侵入完整的杧果组织，只能侵染受伤的组织，但致病力显著下降^[13-14]。本研究同源克隆、分析了漆酶基因Cglac3的序列特征，qRT-PCR分析了其在杧果炭疽病菌侵染寄主过程中、在漆酶缺失突变体ΔLAC1和外切葡聚糖酶基因缺失突变体ΔCg?CBH1中的表达变化，以期为后续揭示漆酶基因家族在C. gloeo?sporides的分子致病机制中的作用奠定基础。

1  材料与方法

1.1材料

供试菌株：胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害研究组提供。

1.2方法

1.2.1Cglac3基因序列特征  用Fungal gDNA Kit（BioMiga）和Fungal RNA Kit（Tiangen）提取总DNA和RNA，并用TIANScript cDNA First- Stand Kit将总RNA反转录为cDNA。参考橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01基因组中ID号为A08557的漆酶基因设计扩增Cglac3的引物（表1）。

1.2.2  qRT-PCR分析Cglac3在侵染过程中及其在突变体DLAC1和DCgCBH1中的表达变化  参考吴秋玉等^[15]的方法，用qRT-PCR分析Cglac3在杧果炭疽病菌侵染杧果叶片0、6、12、24、36、48、72 h过程中的表达，以及在突变体DLAC1和DCgCBH1中的表达，确定Cglac3在侵染过程中的作用及其与漆酶基因LAC1、细胞壁水解酶外切葡聚糖酶基因CgCBH1之间的关系。

1.3  数据处理

采用DNAssist 1.0软件比对分析Cglac3基因DNA和cDNA的序列。采用Primer 5.0 TMHMM、SignalP 4.1 Server等软件分析Cglac3基因的序列特征。采用软件包ExPASy中Computer/MW软件分析蛋白序列。采用BioEdit软件对Cglac3基因的编码序列特征进行分析。采用SOPMA软件分析Cglac3基因的蛋白质二级结构。采用MEGA 7.0构建Cglac3基因编码蛋白系统进化树。

2  结果与分析

2.1Cglac3基因DNA全长片段扩增

根据获得的Cglac3片段序列，以杧果炭疽病菌gDNA为模板，用引物5lac3-F1/R1、3lac3-F1/R1扩增获得了约1600 bp和1500 bp的片段（图1A），测序拼接后全长为2797 bp，包括1842 bp编码区序列以及5?端和3?端非编码区466 bp和489 bp序列。与橡胶树炭疽病菌HBCg01菌株的参考基因（A08557）有46个差异位点，用DNAssist软件初步推测含有3个内含子，开放读码框大小为1731 bp。

2.2Cglac3基因cDNA序列扩增获得

以杧果炭疽病菌gRNA为模板，用引物Rlac3- F1/R1扩增获得了约1700 bp的片段（图1B），测序后与DNA序列拼接比对，发现了3个大小分别为56、51、58 bp的内含子和1个大小1677 bp开放读码框，符合GT-AT法则。其双链核苷酸分子量为1022.14 kDa，（G+C）含量为59.33%，（A+T）含量为40.67%，富含GC碱基。该序列已提交在GenBank，登录号为MN338057。

2.3Cglac3基因预测蛋白的同源性以及预测蛋白的保守域分析

Cglac3开放读码框编码558个氨基酸，SignalP 4.1 Server分析显示前19个氨基酸是信号肽序列。Cglac3蛋白分子量为61.38 kDa，等电点（PI）为4.50，是一种碱性蛋白质，富含极性氨基酸，二级结构中α-螺旋占12.72%，延伸链占27.78%，β-转角占7.53%，无规则卷曲占51.97%（图2）。

系统进化树聚类显示（图3）：Cglac3蛋白与C. fructicolaextracellular dihydrogeodin oxidase gc5蛋白（XP_007273628.1）聚在同一分支上，相似性达94%，与C. gloeos?porioides multicopper oxidase Cg-14（EQB50152.1）基因编码同源性也很高，相关性在90% 以上，与杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1、LAC2的亲缘关系较远。该结果表明Cglac3蛋白可能与茶树炭疽菌（C. fructicola）的oxidase类聚为一类，且与本课题组前期克隆自杧果炭疽病菌的漆酶基因LAC1和LAC2的亲缘关系较远。

利用NCBI的Blast进行该基因保守结构域分析（图4），发现Cglac3蛋白中含有Cu-oxidase-3保守结构域和多个Cu⁺结合位点，表明Cglac3基因是一种含铜的氧化酶（mul?tico?pper oxidase），本研究获取Cglac3是漆酶基因。

2.4qRT-PCR分析Cglac3在侵染过程中及其在突变体ΔLAC1和ΔCgCBH1中的表達变化

由表2可知，在侵染时间6～72 h范围内Cglac3基因都有表达，且表达差异明显。与未侵染对照0 h的表达量相比，Cglac3在6 h孢子萌发形成附着胞时表达量迅速升高，在12 h侵入寄主后达到最高，为15.03，之后在菌丝扩展、叶片显症过程中出现波动，但均远高于0 h的表达量（图5A），可见Cglac3在侵染杧果叶片的不同阶段均发挥着重要的作用，但在侵入期的作用更大。

与野生型相比，Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1缺失敲除突变体中下降了74%（0.26），在外切葡聚糖酶基因CgCBH1缺失敲除突变体中下降了56%，均达到显著差异， LAC1的表达与Cglac3表现一致，也显示出下降（下降了68%）（图5B），表明LAC1调控Cglac3的表达，Cglac3和Cglac1的表达均受外切葡聚糖酶基因CgCBH1的影响。

3  讨论

漆酶是一种糖蛋白，由肽链、糖配基和Cu²⁺三个部分组成，来源不同的漆酶其氨基酸序列相似性不高，但在铜原子结合区域的保守性相当髙^[14]。玉米大斑病菌漆酶基因家族中的9个成员StLAC1～ StLAC9，编码550～613个氨基酸，相似性仅为19.79%～48.70%，StLAC1、StLAC4和StLAC6属于漆酶亚家族1，StLAC2属于漆酶亚家族3，但互补作用不仅存在于StLAC1、StLAC4和StLAC6之间，也在StLAC1和StLAC2之间存在^{[4， 9]}。杧果炭疽病菌中的漆酶基因LAC1编码590个氨基酸^[16]，LAC2编码594个氨基酸^[17]，本研究Cglac3编码558个氨基酸，进化树显示3个成员之间同源性很低，分别聚在不同分支上，可能属于不同亚家族。根据LAC1和Cglac3在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1缺失敲除突变体和外切葡聚糖酶基因敲除突变体中表达推测，LAC1和Cglac3之间表达变化步调一致，可能存在协同作用，这与玉米大斑病菌中漆酶基因StLAC1和StLAC2之间的互补作用截然不同。

DHN黑色素合成途径上有6个酶，漆酶是最后一步将1，8-二羟基萘（DNH）氧化形成黑色素的酶，理论上应该只影响黑色素的合成，与其他侵染相关的细胞壁降解酶如外切葡聚糖酶无关，但本研究发现CgCBH1缺失后，LAC1和Cglac3的表达显著下降，反馈性抑制了漆酶的表达。类似的现象在漆酶基因LAC1和果胶裂解酶基因Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3之间也存在^[18]。

本研究分析了Cglac3基因的结构和功能，并通过qRT-PCR分析Cglac3在侵染过程中及其在突变体ΔLAC1和ΔCgCBH1中的表达变化，本研究结果显示，已从杧果炭疽病菌胶孢炭疽菌中克隆出Cglac3漆酶基因，Cglac3基因的全长cDNA的序列为1667 bp，开放读码框编码558个氨基酸，蛋白分子量为61.38 kDa。Cglac3在杧果炭疽病菌侵染寄主的过程中发挥着重要作用，尤其在侵入后表达最高，是接触初期的15倍。前期研究在杧果炭疽病菌中已发现漆酶家族成员12个，其中LAC1的功能已被敲除鉴定，主要调控分生孢子的产生、菌丝生长、发育、黑色素沉着、漆酶和细胞壁降解酶的产生以及致病力。本研究结果显示Cglac3与LAC1同源性很低，它与LAC1有何功能异同点或与其他漆酶基因是否有协同或互补作用有待进一步的研究，该研究结果为后续鉴定其功能打下了基础，有助于更加全面地了解漆酶基因家族在C. gloeosporides的分子致病机制，也能为未来设计新的杀菌剂提供理论依据。

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