农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

毕方铖+戴宏芬+孟祥春

农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室 广东广州 510640）

摘 要 构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体pCAMBgfp，以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化，以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后，通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子，转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子，且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测，均可扩增出潮霉素基因目的条带，致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。

关键词 胶孢炭疽菌 ；遗传转化 ；突变体 ；致病性

分类号 S432.44

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Mango Colletotrichum gloeosporioides and Screening of the Mutants Defective in Pathogenicity

BI Fangcheng DAI Hongfen MENG Xiangchun

（Fruit Tree Research Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization， Guangdong Academy of Agricultural Science，

Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract The recombinant vector pCAMBgfp， containing hygromycin resistant gene and gfp reporter gene， was constructed and transformed into mango Colletotrichum gloeosporioides via Agrobacterium tumefaciens EHA105. Positive transformants were identified by both resistant to hygromycin and green fluorescence observation. Transformants defective in pathogenicity were screened out through inoculation assay on detached mango leave and fruit. Total 500 positive transformants were screened out from several transformation. The average transformation efficiency was up to 400 transformants per 106 conidia. All of the transformants tested remained stable in hygromycin resistant and gfp fluorescence after several generations of growth in the media absence of hygromycin. 13 candidate mutants were randomly selected for PCR detection of the gfp gene and 8 mutants shown pathogenicity reduction or lose.

Keywords Colletotrichum gloeosporioides ； transformation ； mutants ； pathogenicity

炭疽病菌（Colletotrichum spp.）是世界分子植物病理学研究中十大病原真菌之一，该病菌严重危害重要的经济作物，特别是水果，蔬菜及观赏植物[1]。芒果炭疽病是全世界芒果种植区发生最普遍、为害最严重的病害之一，其主要由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum J.H.Simmonds）两种病原菌引起[2]。目前，尽管多个炭疽菌的基因组测序已完成，且进行了一系列转录组分析[3-5]。但由于炭疽菌种类繁多及植物病原真菌和寄主互作的复杂性，目前对炭疽菌侵染特定植物而致病的各个环节发生机制，特别是对与致病性直接相关的功能基因知之甚少。因此，有必要利用各种特定的炭疽菌-植物互作系统开展研究。

1995年，根癌农杆菌介异转化酿酒酵母首次获得成功[6]，此后，根癌农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）的方法广泛应用于丝状真菌基因功能的研究，且在多种丝状真菌中获得成功[7-8]。目前，虽然国内已有构建橡胶炭疽菌和芒果炭疽菌ATMT突变体库的报道[9-10]，但未获得明显的致病性缺陷转化子。我们从芒果果实上分离了一株胶孢炭疽菌Cg-8，其能侵染芒果、番木瓜、鳄梨等多种热带亚热带水果，且其致病性和培养特征十分稳定，适合作为ATMT方法的受体材料。本研究利用此方法获得了几百个阳性转化子，从中筛选出了一些致病力有明显缺陷的突变体，为分析插入位点的基因在炭疽菌-芒果致病过程中的功能提供了很好的突变材料，为进一步阐明炭疽菌的致病分子机制奠定基础。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒

供试胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌株Cg-8为本实验室保存的从芒果果实上分离得到的单胞培养物；根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105和质粒pCAMBIA1300由中山大学生命科学学院姚楠教授惠赠，质粒pCT-74由广东省农业科学院果树研究所李春雨博士惠赠，为强组成型表达的sGFP的载体，其携带有真菌Pyrenophora tritici-repentis的ToxA启动子，并带有能在真菌中表达的潮霉素B（Hygromycin B）磷酸转移酶基因。

1.1.2 培养基

M3S（Modified Mathur's medium）培养基用于培养胶孢炭疽菌（g/L）[11]：2.5 g MgSO4·7H2O，2.7 g KH2PO4，1 g细菌蛋白胨，1 g酵母提取物，10 g蔗糖，250 mg氯霉素，121℃，1×105 Pa条件下灭菌20 min。

MM培养基用于培养农杆菌EHA105（g/L）：K2HPO4 2.05 g，KH2PO4 1.45 g，NaCl 0.15 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，CaC12 0.051 g，FeSO4·7H2O 0.002 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，Glucose 2.0 g（灭菌后加入），121℃，1×105 Pa条件下灭菌20 min。

IM培养基用于活化农杆菌EHA105 Vir基因（g/L）：MES·2H2O 8.54 g pH 5.3，甘油 5 g，乙酰丁香酮（AS）200 μM（灭菌后加入），K2HPO4 2.05 g，KH2PO4 1.45 g，NaCl 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaC12 0.051 g，FeSO4·7H2O 0.002 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，glucose 1.0 g（灭菌后加入），121℃，1×105 Pa条件下灭菌20 min。

筛选培养基：IM固体培养基中加入100 μg/mL潮霉素B，400 μM 头孢霉素，或者M3S培养基加上述抗生素。

1.2 方法

1.2.1 双元载体pCAMBgfp的构建及鉴定

转化载体pCAMBgfp的构建方法：将经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切产生的含sGFP和潮霉素B抗性基因的片段与经同样双酶切的pCAMBIA1300载体连接而成（图1）。载体经酶切验证正确后转入农杆菌中备用（图1）。

1.2.2 农杆菌菌液的制备

将含有重组质粒pCAMBgfp的农杆菌EHA105在含50 μg/mL Rif和100 μg /mL Kan 的LB平板上划线培养，挑单菌落于5 mL LB液体培养基（含50 μg/mL Rif和100 μg/mL Kan）中，28℃，200 r/min振荡培养48 h。取培养的上述农杆菌菌液按1∶100比例加入至10 mL MM培养基中，在28℃，200 r/min，振荡培养48 h，将上述培养物，室温，2 400 g离心5 min，弃去上清，用适量IM培养基（含乙酰丁香酮）重悬至OD600=0.2左右，然后在28℃，200 r/min条件下诱导培养6～8 h后用于转化。

1.2.3 胶孢炭疽菌的转化

炭疽菌孢子的准备：在已产孢的M3S平板中加入无菌水，轻轻震荡，然后用三层灭菌擦镜纸过滤收集分生孢子，2400 g离心5 min，用IM培养基重悬孢子并调至最终浓度为1×106 个/mL。

转化：首先，将孔径为0.45 μm的无菌Hybond N+尼龙膜平铺于IM+200 μmol/L 乙酰丁香酮平板上。然后，取1.0 mL诱导培养好的农杆菌菌液与1.0 mL浓度为1×106个/mL分生孢子混合，取100 μL混合液均匀涂布于铺有尼龙膜的IM固体培养基上，在25℃避光的条件下共培养48 h。然后将尼龙膜转移至筛选培养基上（含200 μg/mL潮霉素B和400 μmol/L头孢霉素），在25℃下培养2～3 d后揭去尼龙膜，继续培养直至菌落出现。将具有潮霉素抗性的单菌落转接于筛选培养基（含有200 μg/mL潮霉素），并于27℃培养仍具抗性的则为候选的转化子。

1.2.4 转化子的鉴定

取少量转化子的孢子接种于液体M3S培养基中，在27℃，200 r/min条件下培养2 d，用滤纸收集菌丝，用广州东盛生物科技有限公司的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，-20℃保存备用。设计引物HYG-F：5′-AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC-3′，HYG-R：5′-TCTACACAGCCATCGGTCCAG-3′用于扩增潮霉素B抗性基因。同时，随机挑取转化子的菌丝和孢子制片，在ZEISS/德国Axio Observer A1荧光显微镜下观察是否有GFP荧光来进一步鉴定阳性转化子。

1.2.5 致病性缺陷转化子的筛选

取幼嫩芒果叶片，用注射器针头在叶片侧脉上打孔，每片叶上打6个，将转化子带菌琼脂块（直径6 mm）接种到叶片上，菌丝体与叶片表面直接接触，以野生型为对照，初步筛选致病力缺陷的转化子，初筛得到致病力缺陷转化子进一步用孢子液接种芒果果实的方法进行复筛，方法是用无菌水将孢子从平板上冲洗下来，调节浓度至1×106个孢子/mL备用。青熟的象牙芒购于本地市场，用细针在果实上打3排约3 mm深的小孔，每排5个，每孔接种菌液8 μL。同一果实上设一排野生型对照，2排是候选转化子菌液，每个转化子重复接种10个果。将接种好的芒果放置于保湿盘内，27℃培养，接种后第3天开始逐日观察，并测定病斑的直径。endprint

1.2.6 转化子遗传稳定性的鉴定

选取部分炭疽菌转化子，活化后接种到不含潮霉素B的M3S平板上，在温度27℃条件下培养。连续传代5次后，打取各转化子菌落边缘菌丝块，分别接种到含有200 μg/mL潮霉素B的M3S平板上，27℃条件下培养，观察转化子的生长情况，并在荧光显微镜下检测GFP荧光。

2 结果与分析

2.1 潮霉素筛选浓度的确定及插入转化子的获得

为了确定C. gloeosporioides的筛选浓度，取5 μL（106/mL）的孢子液滴在含不同潮霉素浓度培养基的中央，7 d后观察发现，Cg-8在含潮霉素浓度为50 μg/mL的M3S平板上生长微弱，在100 μg/mL潮霉素的M3S平板上生长极其微弱，当潮霉素浓度在150 μg/mL或以上时能够完全抑制Cg-8的生长，因此确定150 μg/mL为筛选转化子的浓度（图2A）。图2B为在筛选培养基上抗性转化子的生长情况。

2.2 转化子验证

经过数次转化实验，共得到500个具有潮霉素抗性的Cg-8转化子，如图3所示。随机挑选了13个转化子，利用PCR扩增潮霉素B抗性基因，13个转化子和阳性质粒pCAMBgfp与pCT-74均能扩增出大小约900 bp的目标片段，而野生型菌Cg-8和阴性对照未扩增出目标片段（图3A）。进一步用荧光显微镜观察到各转化子的菌丝和孢子均有绿色GFP荧光（图3B和3C），说明外源GFP基因能在芒果胶孢炭疽菌中表达。另外，经过多次在无潮霉素的培养基上传代后，仍可同样扩增出潮霉素B抗性基因，并观察到绿色荧光（结果略），说明转化子的潮霉素抗性及GFP荧光能稳定遗传。

2.3 致病性缺陷突变体的筛选

用C. gloeosporioides孢子悬浮液接种离体芒果果实和叶片，对上述经PCR验证为阳性的13个转化子进行致病性分析，结果证明其中有11个转化子的致病性减弱或缺失，另2个转化子的致病性增强。图4表示野生型和部分转化子孢子液接种芒果叶片和果实后的致病情况。同野生型对照Cg-8相比，转化子M14在芒果叶片上的致病性缺失（图4A左一），而M5和M30的致病性略增强。在接种芒果果实时，同野生型对照Cg-8（WT）相比，转化子M2和M3致病性严重减弱，M28的致病性略降低，而M22的致病性没有显著改变。

3 讨论与结论

与原生质体遗传转化体系相比，ATMT方法不需要制备原生质体，简化了操作过程，且有转化效率高，单拷贝插入突变体多等优点[7]。ATMT方法的转化效率受农杆菌菌种，孢子浓度，共培养温度及共培养时间等多种因素的影响[7-8，12-13]，通过优化这些条件可以提高转化效率。国内已有构建橡胶炭疽菌和芒果炭疽菌ATMT突变体库的少数报道，其转化效率在130～1000转化子/106个孢子之间，但致病性验证试验结果表明，未获得明显的致病性缺陷转化子[9-10]。本研究参考已有的报道，首先构建了含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体，然后转入农杆菌EHA105，以其作为转化菌对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化。结果显示，将农杆菌和106/mL孢子等体积混合，在25℃下共培养3天左右，获得400个转化子/106孢子，这与已报道炭疽菌的转化效率相当。本研究所用的载体pCAMBgfp既具有抗生素选择基因，同时还有由Pyrenophora tritici-repentis的ToxA启动子驱动的gfp基因[14]，所以阳性转化子可以通过潮霉素抗性来鉴定，也可以用荧光显微镜来检测，这样就可以跟踪GFP荧光来观察突变体在自然环境条件下的萌发、生长、分布以及侵染果实的过程，有利于更好的研究胶胞炭疽菌致病性相关基因的功能及其与植物之间的相互作用。

利用本研究的ATMT方法，本试验结果筛选得到一些具有明显致病性缺陷的芒果C. gloeosporioides突变体，包括致病力减弱、或丧失、或增强的突变体，这为国内首次报道，为分析插入位点的基因在炭疽菌-芒果致病过程中的功能提供了很好的突变材料，同时验证了此转化和筛选方法的有效性。我们正在进一步利用Tail-PCR确定这些突变体的T-DNA插入位点及其相应基因，并对相应基因的功能开展深入研究，以寻找到更多的炭疽病菌致病性相关功能基因，明确其在炭疽菌-芒果致病过程中的分子作用机制。

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