竹节参总皂苷调节大鼠海马区自噬减轻脑缺血再灌注损伤

黄亚光，欧炳金，冯家腾，杨 彤，冯知涛，梅志刚

（三峡大学医学院，国家中医药管理局中药药理科研三级实验室，湖北宜昌 443002）

脑卒中是严重危害人类健康的神经性疾病，最新的研究显示，全球25 岁以上人群的发生风险为25%，而在我国最高，达39%［1］。缺血性脑卒中作为脑卒中最主要的类型，占60%～80%［2］，并且其发生风险约是出血性脑卒中风险的2 倍［1］。目前，其有效的治疗手段是溶栓，但血液再次灌注很可能给受损组织带来更严重的损伤，即脑缺血再灌注（cerebral ischemia-reperfusion，CIR） 损伤。研究证实，CIR 损伤与炎症、氧化应激、自噬、凋亡、钙超载等有关［3-5］，其中自噬的作用日益成为研究热点［6-7］，有望成为缺血性脑卒中治疗的新策略。竹节参是五加科人参属植物竹节参的干燥根茎，具有抗炎、改善学习记忆、抗肿瘤等功效［8-9］，总皂苷（tRPJSs） 是其有效活性成分，主要包括竹节人参皂苷Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，人参皂苷Re、Rgl、Rg2，三七皂苷R1、R2［9］，可以通过抑制细胞凋亡［10］、降低诱导型一氧化氮合酶活性［11］、抗氧化［12］、抑制兴奋性氨基酸［13］等作用来减轻CIR 损伤，然而它是否能调控自噬尚不清楚。因此，本研究建立大鼠局灶性CIR 损伤模型，探讨竹节参总皂苷对自噬的调节，从而揭示该成分防治缺血性脑卒中的潜在机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级健康雄性成年SD 大鼠40 只，体质量220～250 g，购自三峡大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK （鄂） 2011-0012。

1.2 药物 竹节参购自湖北恩施椿木营竹节参种植基地，经三峡大学医学院何毓敏博士鉴定为五加科植物竹节参Panax japonicusC.A.Mey 的干燥根茎。取药材粗粉，加入60%乙醇回流提取3 次，合并滤液后浓缩干燥，得到总提物粉末。使用前，用生理盐水将其稀释至所需浓度。

1.3 试剂 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）试剂 （批号T8877-5G） 购自美国Sigma 公司；HRP 标记的山羊抗兔、β-actin 抗体购自武汉塞维尔生物有限公司；微管相关蛋白1 轻链3B（LC3B） 兔多抗（批号18725-1-AP）、p62 兔多抗（批号18420-1-AP） 购自武汉三鹰生物技术有限公司；水合氯醛（批号20150629） 购自国药集团化学试剂有限公司。

1.4 仪器 TS-1 水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；LD25-2 型低速离心机（北京京立离心机有限公司）；H-7500 透射电子显微镜（日本日立公司）；DYY-7C 电泳仪及DYCZ-40 电转仪（北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1 分组及给药 40 只大鼠随机分为假手术组、模型组、竹节参总皂苷低剂量组（50 mg／kg）、竹节参总皂苷高剂量组（100 mg／kg），每组各10 只。适应性喂养3 d 后，竹节参总皂苷组大鼠按50、100 mg／kg 的剂量灌胃给药，每天1 次，共7 d，末次给药为术前30 min；假手术组、模型组大鼠灌胃给予生理盐水（5 mL／kg），灌胃时间与竹节参总皂苷组相同。

2.2 局灶性CIR 损伤模型的建立 参照Longa等［14］的方法构建大鼠右侧大脑中动脉阻断缺血（MCAO） 模型。大鼠末次给药30 min 后，10%水合氯醛（3.5 mL／kg） 腹腔注射麻醉，仰卧固定，剃去颈部毛发，酒精消毒，沿颈正中线切口，依次暴露右侧颈总、颈外及颈内动脉。结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，于颈总动脉分叉下方约5 mm处剪一 “V”型切口，将线栓 （长4 cm，直径0.25 mm） 从开口处插入，置于颈内动脉17～18 mm，到有轻微阻力感为止，结扎颈内和颈总动脉远心端以固定线栓，逐层缝合皮肤。大鼠缺血1.5 h 后，拨出线栓再灌注24 h。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分支，不闭塞大脑中动脉，其他操作相同。术中、术后室温严格控制在24～25 ℃，大鼠体温维持在36.5～37.5 ℃。

2.3 神经功能评分 再灌注24 h 后，评估各组大鼠神经功能损伤，参照Longa 等［14］报道的方法进行神经功能评分：0 分，神经功能无障碍；1 分，提尾时向对侧前肢屈曲；2 分，不能直行，大鼠向左侧旋转；3 分，行走困难，行走时向对侧倾倒；4 分，严重意识障碍，无自发活动或意识不清。神经功能评分在0～3 分的大鼠表明造模成功，纳入实验，评分为4 分的剔除。

2.4 TTC 染色计算脑梗死体积 神经功能评分后，每组随机选取3 只大鼠，麻醉后断头取脑，去嗅球、小脑和低位脑干，-20 ℃冷冻20 min 后沿冠状面切成厚度基本相同的5 片，置于2% TTC 染色液中，37 ℃避光孵育30 min，置于4%多聚甲醛溶液中固定过夜，取出切片拍照。采用Image J 图像分析软件测量大鼠脑梗死体积。脑梗死范围百分比＝ ［5 片大脑总梗死区体积（白色区域） ／5 片大脑总体积（整个大脑体积）］×100%。

2.5 透射电镜检测自噬小体 再灌注24 h 后，每组随机选取3 只大鼠，麻醉后生理盐水灌注至肝脏及四肢发白，后继续灌注4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定至肝脏及四肢变硬，冰上断头取脑，分离脑组织，于缺血侧海马靠近CA1 区取一体积约1 mm3的脑组织块，置于2.5% 戊二醛溶液固定24 h。PBS 漂洗3 次，1%锇酸溶液4 ℃固定1 h，然后梯度乙醇溶液脱水，丙酮置换、浸透，环氧树脂包埋。-80 ℃下聚合24 h 后，将组织块制成60～70 nm厚的超薄切片，3%柠檬酸铅-醋酸双氧铀双染色，透射电子显微镜观察海马组织细胞中自噬小体的形成情况。

2.6 Western blot 检测LC3、p62 蛋白表达 再灌注24 h 后，各组随机选取3 只大鼠，麻醉后迅速断头取脑，称取约0.3 g 海马组织制备蛋白样本，BCA 法检测各样本蛋白浓度。取30 μg 样本上样，以12%分离胶电泳分离，蛋白转移至PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗LC3 B （1∶1 000）、p62 （1∶2 000） 后4 ℃摇床孵育过夜。TBST 洗膜3 次 （10 min／次），将PVDF 膜封入HRP 标记的二抗（山羊抗兔） 稀释液（1∶2 000）中，室温摇床孵育1 h，TBST 洗膜3 次 （每次10 min）。按照A 液、B 液1∶1 的比例配置ECL显影液，将PVDF 膜充分浸入显影液后放入凝胶成像仪器内显影，实验重复3 次。以β-actin 作为内参，Image J 软件进行灰度值分析。

2.7 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件处理，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVE），两两比较采用LSD 法（方差齐性时） 或Dunnett’s T3 法（方差不齐时）。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 竹节参总皂苷对神经功能损伤的影响 模型组大鼠表现出严重的神经功能损伤情况，与假手术组大鼠相比其神经功能评分升高（P＜0.01）；与模型组相比，竹节参总皂苷组大鼠神经功能评分均降低（P＜0.01）。见表1。

表1 竹节参总皂苷对大鼠神经功能损伤的影响（，n＝10）Tab.1 Effects of tRPJSs on neurological deficit of rats（，n＝10）

表1 竹节参总皂苷对大鼠神经功能损伤的影响（，n＝10）Tab.1 Effects of tRPJSs on neurological deficit of rats（，n＝10）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.2 竹节参总皂苷对脑梗死的影响 白色部分表示脑梗死区域，红色部分表示非梗死区域。与假手术组相比，模型组大鼠脑梗死增加（P＜0.01）；与模型组相比，竹节参总皂苷组大鼠脑梗死均减小（P＜0.01），高剂量组更明显。见图1、表2。

图1 竹节参总皂苷对大鼠脑梗死的影响Fig.1 Effects of tRPJSs on cerebral infarct of rats

表2 竹节参总皂苷对大鼠脑梗死的影响（， n＝3）Tab.2 Effects of tRPJSs on cerebral infarct of rats （，n＝3）

表2 竹节参总皂苷对大鼠脑梗死的影响（， n＝3）Tab.2 Effects of tRPJSs on cerebral infarct of rats （，n＝3）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.3 竹节参总皂苷对缺血侧海马CA1 区神经元细胞形态及自噬小体形成的影响 假手术组大鼠海马神经元可见结构完整的细胞核、线粒体、溶酶体和内质网，而模型组大鼠神经元细胞器损伤，线粒体肿胀变形，部分线粒体内峭溶解消失，透明成空泡，可见包含内融物的自噬体及自噬溶酶体结构。竹节参总皂苷组与模型组相比，可见神经细胞核膜超微结构较完整、清晰，周围可见内含胞浆成分的自噬体，也可见到少量单层膜，胞浆成分已降解的自噬溶酶体，且竹节参总皂苷高剂量组细胞损伤程度低于低剂量组。见图2。

图2 竹节参总皂苷对大鼠缺血侧海马CA1 区自噬小体形成的影响（×5 000）Fig.2 Effects of tRPJSs on neuronal cell morphology and the formation of autophagosomes in CA1 area of ischemic hippocampus of rats （×5 000）

3.4 竹节参总皂苷对大鼠缺血侧海马中LC3、p62蛋白表达的影响 与假手术组相比，模型组LC3-Ⅱ表达升高，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值增加，p62 表达降低（P＜0.01）；与模型组相比，竹节参总皂苷组LC3-Ⅱ表达均下调，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值降低，p62表达上调（P＜0.01）。见图3、表3。

图3 竹节参总皂苷对大鼠缺血侧海马中LC3 和p62 蛋白表达的影响Fig.3 Effects of tRPJSs on the protein expressions of LC3 and p62 in ischemic hippocampus of rats

表3 竹节参总皂苷对大鼠缺血侧海马中LC3 和p62 蛋白表达的影响（， n＝3）Tab.3 Effects of tRPJSs on the protein expressions of LC3 and p62 in ischemic hippocampus of rats （， n＝3）

表3 竹节参总皂苷对大鼠缺血侧海马中LC3 和p62 蛋白表达的影响（， n＝3）Tab.3 Effects of tRPJSs on the protein expressions of LC3 and p62 in ischemic hippocampus of rats （， n＝3）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

4 讨论

缺血性脑卒中是由于脑缺血或血管堵塞造成大脑血流供应不足，引起脑组织损伤的一种疾病。目前，r-tPA 溶栓治疗是美国FDA 唯一批准的疗法，然而溶栓再灌注可能会进一步引起或加重一系列病理改变［15-16］，诱发CIR 损伤的发生，继而导致不可逆的神经损伤。因此，如何有效的防治再灌注损伤的发生至关重要。

竹节参是湖北省特色药用植物，其主要活性成分是竹节参总皂苷。研究显示，竹节参总皂苷能通过抑制一氧化氮合酶和诱导型一氧化氮合酶的过度表达改善局灶性CIR 大鼠的脑损伤［11］。另有研究也发现，50、100 mg／kg 竹节参总皂苷能显著提高CIR 大鼠脑组织的超氧化物歧化酶活力，降低乳酸脱氢酶活性和丙二醛含有量，抑制脑组织水肿［12］，提示竹节参总皂苷可能通过抗氧化应激和改善毛细血管通透性减轻CIR 损伤。新近的研究发现，竹节参的药理作用可能与其对自噬的调控有关，邓丽丽等［17］通过在SH-SY5Y 细胞中预孵育竹节参总皂苷发现，竹节参总皂苷能显著逆转H2O2处理导致的LC3-Ⅱ和Beclin1 蛋白的下调，推测竹节参总皂苷可能通过诱导自噬，减轻细胞氧化损伤，从而提高细胞的抗氧化能力。Wang 等［18］的研究发现，竹节参总皂苷能通过AMPK／mTOR／Ulk1 通路激活自噬，从而减轻异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化。然而，竹节参总皂苷对CIR 损伤的保护作用是否通过调控自噬尚未有报道。

基于上述理论，本研究试图探讨竹节参总皂苷预处理对CIR 损伤的保护作用，并验证竹节参总皂苷通过调控自噬发挥作用。通过提前7 d 预给药处理，MCAO 模型缺血1.5 h 再灌注24 h 后检测相应的指标。结果显示，与模型组相比，竹节参总皂苷预处理能够显著改善CIR 24 h 后大鼠的神经功能缺损，减轻脑梗死，改善神经元细胞结构，提示竹节参总皂苷预处理能够发挥神经保护作用。

自噬体被认为是目前检测自噬的金标准，能够直观的显示组织细胞内自噬的情况。自噬体是自噬过程中形成的一种包裹有受损细胞器或蛋白质的囊泡，具有双层膜结构，与溶酶体融合后变成单层膜结构［19］。LC3 是自噬过程中最重要的分子，以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式存在，主要参与自噬体的形成［20］。自噬底物蛋白p62 通过在C 端与泛素化蛋白结合以及N 端与LC3-Ⅱ结合参与自噬的降解［21］，同时检测LC3 和p62 可以反应自噬的完整性。本研究中透射电镜结果显示，竹节参总皂苷预处理可以显著改善大鼠缺血侧海马神经细胞损伤，减少自噬体的形成；Western blot 结果显示，竹节参总皂苷预处理能显著降低LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值，上调p62 蛋白表达，推测竹节参总皂苷预处理发挥神经保护作用可能是通过抑制大鼠CIR 24 h 后自噬的过度产生而实现的。

综上所述，竹节参总皂苷预处理可能通过抑制大鼠CIR 24 h 后海马区的过度自噬，而发挥对CIR损伤的保护作用。然而竹节参总皂苷调控自噬的具体作用机制尚需进一步探索，明确其在CIR 损伤中的具体作用机制。