HPLC 法同时测定藤黄健骨胶囊中9 种成分

2020-08-04陈海燕刘华东韦素华

中成药 2020年7期

陈海燕，刘华东*，李冰，韦素华

（1.广西卫生职业技术学院，广西南宁 530023； 2.广西明合药业有限责任公司，广西南宁 530020）

藤黄健骨胶囊现收录于《国家食品药品监督管理总局药品标准》（YBZ06272008），由熟地黄、鸡血藤、淫羊藿、鹿衔草、肉苁蓉、炒莱菔子、烫骨碎补7 味药材加工而成，具有补肾、活血、止痛的功效，临床上主要用于肥大性脊椎炎、颈椎病、跟骨刺、增生性关节炎、大骨节病等病症的治疗［1］，对肾虚血瘀型骨质疏松症［2］、腰椎间盘突出症［3］、腰椎骨折合并严重骨质疏松症［4］、椎动脉型颈椎病［5］、原发性骨质疏松症［6］、骨性关节炎［7］、早期四肢骨折［8］、腰肌劳损［9］等疾病的临床疗效显著。但目前该制剂现行质量标准和文献［10-11］仅对方中臣药淫羊藿所含淫羊藿苷进行定量分析，尚无多组分含有量测定的报道。因此，本实验采用HPLC 法同时测定藤黄健骨胶囊中君药熟地黄活性成分梓醇、地黄苷D、益母草苷，臣药淫羊藿活性成分淫羊藿苷、宝藿苷I，佐药鸡血藤活性成分儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素的含有量，建立该制剂多指标成分的质量控制模式，以期为全面评价其质量提供数据支持。

1 材料

Dionex UltiMate3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；BS110S 型电子分析天平（德国Sartorious 公司）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。儿茶素（批号110877-201604，纯度99.2%）、表儿茶素（批号110878-201703，纯度99.7%）、淫羊藿苷（批号110737-201516，纯度94.2%）、宝藿苷I（批号111852-201603，纯度99.9%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；地黄苷D （批号14061708，纯度98.8%）对照品购自成都普瑞法科技开发有限公司；梓醇（批号17071021，纯度98.6%）、益母草苷（批号18052422，纯度94.6%）、甘草素（批号18111522，纯度99.4%）、美迪紫檀素（批号18040322，纯度100.0%）对照品均购自上海同田生物技术股份有限公司。熟地黄、鸡血藤、淫羊藿、鹿衔草、肉苁蓉、炒莱菔子、烫骨碎补均购自广西岑溪市安阳堂药业有限公司，经广西卫生职业技术学院陈海燕讲师鉴定为正品，按2015 年版《中国药典》一部各药材质量标准检验均符合相关规定。藤黄健骨胶囊（每粒装0.25 g，批号181104、190105、190406）购于甘肃省西峰制药有限责任公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shim-pack GIST C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0～10.0 min，5.0%A；10.0～25.0 min，5.0%～10.0% A；25.0～47.0 min，10.0% →39.0% A；47.0～63.0 min，39.0%～45.0%A；63.0～70.0 min，45.0%～5.0%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；0～25.0 min在210 nm 波长处检测梓醇、地黄苷D、益母草苷［12-13］，25.0～47.0 min 在280 nm 波长处检测儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素［14-15］，47.0～70.0 min 在270 nm 波长处检测淫羊藿苷、宝藿苷I［1，10-11，16-17］；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷和宝藿苷I 对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为2.178、0.982、1.354、0.918、1.212、0.108、0.136、3.012、1.988 mg／mL 的贮备液，各精密量取2.5 mL，置于50 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（含梓醇108.9 μg／mL、地黄苷D 49.1 μg／mL、益母草苷67.7 μg／mL、儿茶素45.9 μg／mL、表儿茶素60.6 μg／mL、甘草素5.4 μg／mL、美迪紫檀素6.8 μg／mL、淫羊藿苷150.6 μg／mL、宝藿苷I 99.4 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液取胶囊20 粒，倾出内容物，研细混匀后精密称取2.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，称定质量，超声（300 W、40 kHz）提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按胶囊处方比例和生产工艺，分别制备缺熟地黄、缺鸡血藤、缺淫羊藿的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，色谱图基线平稳，各成分与其他杂质峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分计均不低于3 500，阴性无干扰。

2.4 线性关系考察精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6 个20 mL 量瓶中，甲醇制成6 个质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 峰面积RSD 分别为 0.77%、0.95%、0.78%、0.81%、0.99%、1.12%、1.06%、0.51%、0.64%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验取同一批胶囊，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 峰面积RSD 分别为1.02%、1.35%、1.20%、1.47%、1.19%、0.85%、1.79%、0.97%、1.06%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验按“2.2.2”项下方法制备1份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 峰面积RSD 分别为0.79%、0.96%、0.75%、0.86%、1.03%、1.11%、1.07%、0.53%、0.67%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.8 加样回收率试验精密称取梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 含有量已知（1.478、0.656、0.894、0.536、0.722、0.058、0.072、2.124、1.198 mg／mL）的胶囊内容物9 份，每份1.0 g，置于具塞锥形瓶中，按照2015 年版《中国药典》规定加入对照品溶液0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 平均加样回收率分别为99.71%、98.91%、99.26%、97.94%、98.32%、96.97%、96.95%、100.01%、98.96%，RSD 分别为 0.83%、0.96%、1.09%、1.45%、1.32%、0.99%、1.17%、0.76%、1.25%。

2.9 样品含有量测定取3 批胶囊，按“2.2.2”项下方法平行制备3 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／粒， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／capsule， n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分筛选藤黄健骨胶囊中熟地黄补血滋阴，益精填髓，为君药，梓醇、益母草苷、地黄苷D 等环烯醚萜苷类为其主要活性成分；淫羊藿补肾阳，强筋骨，祛风湿，为臣药，淫羊藿苷、宝藿苷I 等黄酮类为其主要活性成分；鸡血藤活血补血，舒筋活络，为佐药，儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素等黄酮类为其主要活性成分。根据中药质量标志物确认原则，本实验选择梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 作为指标成分。

3.2 供试品溶液制备方法筛选本实验首先考察不同提取溶剂（甲醇［10，13，16］、50%甲醇［12］、乙醇、50%乙醇［1，11，15，17］）对藤黄健骨胶囊中9 种成分综合提取率的影响，发现甲醇提取时最高，色谱图中杂质峰数量少。再考察不同提取方式（超声提取法［1，10-14］、回流提取法［15］、索氏提取法），发现各成分综合提取率差异不大，考虑到制备便捷性和结果准确性，采用超声提取。最后考察不同提取时间（30、60、90 min）。最终确定，供试品溶液制备方法为甲醇超声提取30 min。

3.3 流动相筛选本实验考察乙腈-水［1，10-12，16-17］、乙腈-0.2%磷酸［13-14］、乙腈-0.1%甲酸［15］流动相体系，发现以乙腈-0.2%磷酸洗脱时色谱峰分离度较好，基线平稳，故选择其作为流动相。进一步对流动相比例进行优化，最终确定为“2.1”项下梯度洗脱程序。