内质网应激在创伤致大鼠心肌细胞凋亡中的作用*

于雪娇 ， 何金玲 ， 杨博文 ， 焦向英 ，2， 曹济民 ，2， 贺忠梅 ，2， 燕 子 ，2△

（山西医科大学 1基础医学院生理学系，2细胞生理学教育部重点实验室，山西太原030001）

随着我国城市现代化建设的高速发展，交通业、建筑业等发生意外事故造成的创伤患者逐年增多。临床研究表明，创伤不仅可直接损伤心脏，还可导致继发性心脏损伤（trauma-induced secondary cardiac injury，TISCI）［1］。此类患者在创伤后 24 h 内无任何心功能指标的异常，但在创伤后数天或数周出现心功能障碍，病情隐匿，极易漏诊，死亡风险极高［2］。

已有研究证实，心肌细胞凋亡是TISCI的主要原因［3］，但其具体机制尚不清楚。本课题组前期研究显示，在引起创伤大鼠心肌细胞凋亡的主要途径中，介导内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）凋亡途径的关键分子caspase-12最早被激活。应激、缺血、缺氧等多种病理因素刺激可导致内质网稳态失衡，从而引起 ERS［4］。短暂而轻微的 ERS 发生时，内质网上的跨膜传感器转录激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和需肌醇酶 1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）介导的3 条信号通路相继被激活，诱导适应性反应以维持内质网稳态，进而保护细胞。但若ERS时间延长或加剧时，ERS凋亡途径被激活，导致细胞凋亡［5］，进而参与多种疾病的发生发展。本研究应用Noble-Collip 创伤仪构建机械创伤大鼠模型，通过检测ERS 及其凋亡途径的激活情况，探讨创伤致大鼠心肌细胞凋亡的潜在机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 试剂 Krebs-Henseleit（K-H）液、蛋白酶抑制剂 PMSF、RIPA 裂解液、磷酸酶抑制剂、BCA 蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（博士德生物工程有限公司）；抗GAPDH 抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG 和HRP 标记的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；抗葡萄糖调节蛋白78（glucoseregulated protein 78，GRP78）、IRE1α、p-IRE1α、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、caspase-12 和 caspase-3 抗体（Abcam）；抗 PERK、p-PERK 和 cleaved caspase-3 抗体（Cell Signaling Technology）；抗ATF6 抗体（Santa Cruz）；4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）购自 Sigma；caspase-3 活性检测试剂盒（南京碧波生物科技有限公司）。

1.2 动物 清洁级健康雄性SD 大鼠，6～8 周龄，体质量180～220 g，由山西医科大学实验动物中心提供［合格证号为SCXK（晋）2015-0001］。

2 方法

2.1 实验大鼠的分组及模型的构建 将大鼠随机分为伪创伤（sham）组（n=6）、创伤（trauma）组（创伤后 0 h、3 h、6 h、12 h 和24 h 各时点n=6）和创伤+ERS抑制剂4-PBA 组（n=6）。按照参考文献［6-7］的方法对大鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉成功后置于直径30 cm的Noble-Collip 创伤仪中，创伤仪以40 r/min 的速率运行5 min，共200 r。伪创伤组大鼠被胶带固定于创伤仪内，在转动过程中不会跌落造成损伤；创伤组和创伤+4-PBA 组大鼠每转动1 圈跌落1 次，进而造成创伤；创伤+4-PBA 组大鼠在创伤后即刻腹腔注射4-PBA（100 mg/kg）。

2.2 大鼠离体心功能检测 大鼠麻醉后，迅速开胸取心脏，放入预冷的K-H 液中，迅速修剪后将主动脉固定到Langendorff 灌流装置上，以K-H 液行主动脉逆行灌流，保证恒压100 cmH2O，恒温37℃，并充以95%氧气和5%二氧化碳混合气体。待心脏稳定跳动后，将带球囊的心导管经过房室瓣置于左心室内，球囊内充有灌流液，使左心室舒张末压维持在10 mmHg。球囊导管另一端与压力换能器相连，待各项心功能指标稳定后对左室内压进行采集。采用BL-410生物信号记录分析系统记录大鼠±dp/dtmax数据。

2.3 大鼠心肌组织样品的制备 伪创伤组大鼠经创伤仪运转5 min 后处死；创伤组大鼠按照创伤后不同时点依次处死；创伤+4-PBA 组大鼠在ERS 标志物表达最高的时点即创伤后6 h处死。处死大鼠后，开胸，取心脏，于4℃磷酸盐缓冲液中洗去残余血液，冰上取心尖组织，剪碎，裂解，提取蛋白用于后续实验。

2.4 Western blot 制胶，上样，电泳，转膜，封闭，孵育I抗（GRP78抗体按1∶2 500稀释，PERK、p-PERK、IRE1α、p-IRE1α 和 caspase-12 抗体按 1∶1 000 稀释，ATF6、CHOP 和caspase-3 抗体按1∶500 稀释），4℃过夜；用洗涤缓冲液洗膜3 次，每次10 min，孵育II 抗2 h（HRP标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的山羊抗小鼠 IgG 按1∶2 000 稀释）；洗膜，用UVP 凝胶成像系统曝光。以目的蛋白灰度值与内参照GAPDH 灰度值的比值反映蛋白表达水平。

2.5 caspase-3 活性检测 取各组心肌组织，裂解，测定蛋白浓度，根据分组在96 孔酶标板上设置空白对照孔和样品孔；按照说明书依次加入样品裂解液、反应缓冲液和底物。催化底物Ac-DEVD-pNA（acetyl-Asp-Glu-Val-Aspp-nitroanilide）被 caspase-3 剪切后，会产生黄色的pNA，用酶标仪测定的吸光度（A）可反映caspase-3的活性。

3 统计学处理

用GraphPad Prism 7.0 软件统计并作图。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较用单因素方差分析及LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 创伤导致大鼠离体心功能降低，心肌组织凋亡执行蛋白caspase-3活性增强

与伪创伤组相比，创伤组大鼠24 h 内各时点（0、3、6、12 和 24 h）心电图、平均动脉压及在体心功能（包括±dp/dtmax）均未出现显著异常，心脏、肝脏、肾脏和肠管均未出现显著出血，仅观察到肝脏和肠管轻度充血，且创伤大鼠通常在创伤后1～3 h 苏醒，24 h内生存率100%。但离体心功能指标±dp/dtmax均在创伤后24 h显著降低（P＜0.05或P＜0.01），见表1。

表1 创伤24 h内大鼠离体心功能指标±dp/dtmax的变化Table 1.Changes of ex vivo cardiac function indexes±dp/dtmax in rats within 24 h of trauma（mmHg/s.Mean±SD. n=6）

与伪创伤组相比，创伤组大鼠心肌组织中凋亡执行蛋白caspase-3 活性形式（cleaved caspase-3）在创伤后6 h 显著增加（P＜0.05），12 h 达到最高峰（P＜0.01），见图1A；caspase-3 活性检测试剂盒的结果同样显示，caspase-3 活性在创伤后6 h 显著升高（P＜0.01），12 h达到最高水平（P＜0.01），见图1B。

Figure 1.The expression and activity of apoptotic execution protein caspase-3 in rat myocardial tissues at different time points after trauma.A:the protein levels of caspase-3 and cleaved caspase-3 detected by Western blot；B:activity of caspase-3 determined by commercially available kit.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group.图1 创伤后不同时点凋亡执行蛋白caspase-3在大鼠心肌组织中的表达和活性

2 创伤诱导大鼠心肌组织ERS 标志分子GRP78、ATF6、p-PERK和p-IRE1α水平升高

与伪创伤组相比，创伤组大鼠心肌组织GRP78蛋白表达在创伤后3 h开始显著增加（P＜0.05），在创伤后6 h 达到最高水平（P＜0.01），见图2A；ATF6 蛋白表达在创伤后6 h 开始增加（P＜0.05），12 h 达到最高水平（P＜0.01），见图2B；PERK和IRE1α表达在创伤后无显著变化（P＞0.05），但磷酸化水平在创伤后3 h 显著升高（P＜0.05），6 h 达到最高（P＜0.01），见图2C、D。

3 创伤导致大鼠心肌组织ERS 相关凋亡蛋白CHOP表达升高及caspase-12活化

与伪创伤组相比，创伤组大鼠心肌组织CHOP表达在创伤后6 h 显著增加（P＜0.05），12 h 达到最高水平（P＜0.01），见图3A；caspase-12 活性形式（cleaved caspase-12）在创伤后 3 h 水平升高（P＜0.05），6 h达到高峰（P＜0.01），见图3B。

4 抑制ERS 可降低创伤大鼠心肌组织CHOP 表达并抑制caspase-12活化

与创伤组相比，给予ERS 抑制剂4-PBA 后，创伤大鼠心肌组织CHOP 和cleaved caspase-12 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图4。

Figure 2.The expression and phosphorylation levels of ERS marker molecules GRP78，ATF6，PERK and IRE1α in rat myocardial tissues at different time points after trauma.A:GRP78 protein expression level；B:ATF6 protein expression level；C:PERK protein expression and phosphorylation levels；D:IRE1α protein expression and phosphorylation levels.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group.图2 创伤后不同时点ERS标志分子GRP78、ATF6、PERK和IRE1α在大鼠心肌组织中的表达和磷酸化水平

5 抑制ERS可减少创伤大鼠心肌组织caspase-3活化

与创伤组相比，给予4-PBA 干预后创伤大鼠心肌组织中cleaved caspase-3 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图5A；采用caspase-3 活性检测试剂盒对心肌组织caspase-3 活性进行测定，结果同样显示，4-PBA 干预后创伤大鼠心肌组织caspase-3活性显著下调（P＜0.05），见图5B。

讨 论

TISCI 是一种隐匿性疾病，常因贻误治疗时机导致患者死亡［8］，而其具体发病机制尚不清楚。已有的研究表明，在创伤动物模型中，创伤可导致心肌细胞凋亡，进而引起心功能降低及随后的继发性心脏损伤［6，9］。引起细胞凋亡通常有 3 条途径:死亡受体途径、线粒体途径和ERS 途径［10］。在前期研究中，本课题组对介导3 条凋亡途径的标志性蛋白caspase-8、caspase-9和caspase-12分别进行了活性检测，显示介导 ERS 凋亡途径的 caspase-12 最早被激活［7］。为了探讨创伤是否通过激活ERS 进而导致大鼠心肌细胞凋亡，本研究首先根据参考文献［6］和课题组既往研究成功复制造成继发性心脏损伤的创伤大鼠模型［7，11-12］，并对创伤大鼠心肌组织凋亡的发生进行验证，结果显示凋亡执行蛋白caspase-3被活化，证实创伤可诱导心肌细胞凋亡。

为了观察创伤后ERS 的发生情况，我们对ERS标志分子进行检测。GRP78 是内质网分子伴侣蛋白，通常以其表达增高作为 ERS 发生的标志［13］；而ATF6、IRE1α 和 PERK 是内质网膜蛋白，是 ERS 的传感器，过度 ERS 时，GRP78 与 ATF6、IRE1α 和 PERK解离，进而激活这3 个传感器［14］。本研究结果表明，创伤导致 GRP78 的解离及 ATF6、IRE1α 和 PERK 的激活，引起ERS 的发生。为了进一步探讨创伤是否激活ERS凋亡途径，我们对ERS凋亡相关蛋白CHOP及caspase-12 进行检测。CHOP 由内质网膜蛋白PERK 和 ATF6 共同激发［15-16］；caspase-12 的活化是由内质网膜蛋白IRE1α 磷酸化触发的［14］。本研究结果显示，CHOP 及caspase-12在创伤后表达水平显著上调，推测创伤引起的大鼠心肌细胞凋亡可能与ERS凋亡途径的激活有关。

Figure 3.The expression and activation levels of ERS-related apoptosis proteins CHOP and caspase-12 in rat myocardial tissues at different time points after trauma.A:CHOP protein expression level；B:caspase-12 and cleaved caspase-12 protein levels.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group.图3 创伤后不同时点ERS相关凋亡蛋白CHOP和caspase-12在大鼠心肌组织中的表达和活性水平

Figure 4.The effects of ERS inhibitor 4-PBA treatment on the expression and activation of ERS-related apoptosis proteins CHOP and caspase-12 in traumatic rats.A:CHOP protein expression level；B:caspase-12 and cleaved caspase-12 protein levels.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs trauma group.图4 ERS抑制剂4-PBA处理对ERS相关凋亡蛋白CHOP表达和caspase-12活化的影响

Figure 5.The effects of ERS inhibitor 4-PBA treatment on the activation of caspase-3 in traumatic rats.A:caspase-3 and cleaved caspase-3 protein levels detected by Western blot；B:activity of caspase-3 determined by commercially available kit.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs trauma group.图5 ERS抑制剂4-PBA处理对创伤大鼠心肌组织caspase-3活化的影响

为了进一步明确ERS 凋亡途径的激活对创伤致大鼠心肌细胞凋亡的作用，我们给予创伤大鼠ERS抑制剂 4-PBA 处理［17］，结果显示，抑制 ERS 可降低ERS 相关凋亡蛋白 CHOP 和 caspase-12 的表达，阻断ERS 凋亡途径；也可下调凋亡执行蛋白caspase-3 的活性。以上结果证实创伤引起的大鼠心肌细胞凋亡是ERS凋亡途径激活所致。

综上所述，本研究显示创伤早期可诱发大鼠心肌组织ERS的产生，进而激活ERS凋亡通路，最终导致细胞凋亡。这为TISCI 的发病机制提供了新的实验依据。