Rab11-FIP4通过IGF1R调控结直肠癌细胞迁移和侵袭*

陈 露， 潘纯纯， 郑 波， 裴继华， 卢光荣， 薛战雄

（温州医科大学附属第二医院消化内科，浙江温州325000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界上常见的肿瘤之一［1-2］。2015 年中国有 37.63 万新诊断为CRC 的患者和19.1 万死于结直肠癌的病例［3］。目前结直肠癌的诊断技术和临床治疗效果有所提高，但由于复发和转移的风险，结直肠癌患者，尤其是晚期结直肠癌患者的预后仍然很差［4］。据统计约有50%的结直肠癌患者发生远处转移，特别是肝转移［5］，而引起结直肠癌进展和转移的确切分子机制尚未明确。

Rab11 家族相互作用蛋白4（Rab11-family interacting protein 4，Rab11-FIP4）是在人类基因组计划中被首先发现的，当时被称为KIAA1821基因［6］。Rab11-FIP4 的C 末端含有一个 Rab11 结合区（Rab11 binding domain，RBD），选择性地与 Rab11 的GTP 结合形式相互作用［5］，其 N 末端含有 EF 手钙结合基序［7］。Rab11-FIP4 定位于细胞内的再循环内体，作为Rab11 的下游调节剂调节囊泡运输［8-9］。研究表明，肝细胞癌中Rab11-FIP4 通过激活雷帕霉素/AKT1 底物 1 发挥促转移的作用［10］。然而，Rab11-FIP4在结直肠癌中的潜在影响尚不明确。本研究将探讨Rab11-FIP4 在结直肠癌发生发展中的作用、临床意义及相关机制，探究Rab11-FIP4 在临床治疗结直肠癌中的可能性。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 临床样本 收集温州医科大学附属第二医院2009 年 1 月～2015 年 10 月期间的 100 例结直肠癌患者的组织样本，并同时取得50 例配对的癌旁正常组织。结直肠癌的病理学诊断由不知情的病理学医生确认。本研究经温州医科大学伦理委员会审核批准，所有参与此研究的患者均签署知情同意书。

1.2 细胞株 人结直肠癌细胞株（LoVo 和HCT116）获自中国科学院上海细胞库。

2 方法

2.1 免疫组织化学染色 构建组织芯片，根据既往研究进行免疫组织化学染色和免疫染色评分［11］。将组织芯片脱蜡，再水化，用2%正常山羊血清（Thermo Fisher Scientific 于）37℃封闭90 min。在免疫组化分析中使用Vectastain Elite ABC 试剂盒（Vector Laboratories）。将组织切片（5 μm）与Rab11-FIP4；1∶50；Sigma-Aldrich）和缺氧诱导因子 1α（hypoxia-indacible factor 1α，HIF-1α）（1∶100；Thermo Fisher Scientific）I 抗在4℃条件下孵育过夜。使用DAB 过氧化物酶底物试剂盒（Agilent Technologies）在37℃下使相应的Ⅱ抗显色20 min。用苏木精和伊红在37℃下使细胞染色90 s。显微镜（×400）观察组织切片。使用Image-Pro Plus 6.0 软件（Media Cybernetics）计算A，并且从每个样本3个图像中计算平均A。

2.2 细胞培养和缺氧条件 将LoVo 和HCT116 细胞在含有10%胎牛血清（Gibco）、青霉素（1×104U/L；Thermo Fisher Scientific）和链霉素（10 mg/L；GE Healthcare Life Sciences）的DMEM 培养液（Gibco）中培养。两种细胞株都在37℃、94%N2、5%CO2和1%O2构成的缺氧条件下培养48 h。

2.3 Rab11-FIP4 过表达慢病毒的构建 将Rab11-FIP4 开放阅读框序列（NM_032932.5）克隆到pWPXL 载体（Addgene）中，构建pWPXL-Rab11-FIP4重组质粒。使用LipofectamineTM2000 转染试剂（Thermo Fisher Scientific）将 pWPXL-Rab11-FIP4、psPAX2（包装质粒）和pMD2.G（包膜质粒）共转染293T 细胞。转染48 h 后收获慢病毒，在聚凝胺（6 mg/L；Sigma-Aldrich）存在的条件下，以MOI=10 用慢病毒感染结直肠癌细胞。

2.4 RT-qPCR 使用 TRIzol 试剂（Thermo Fisher Scientific）从细胞和组织中提取总RNA，并使用PrimeScriptTMRT 试剂盒（TaKaRa）在50 μL 总体积中进行逆转录。逆转录反应在37℃下进行15 min，然后在85℃下进行5 s。cDNA 在-20℃下保存备用。随后使用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）进行qPCR。PCR 条件:95℃ 15 s；95℃ 5 s，60℃ 40 s，35 个循环。使用β-actin 作为内参照，并通过2-ΔΔCt法（ΔCt=ΔCt目的基因-ΔCtβ-actin）计算相对表达水平［12］。Rab11-FIP4 的上游引物序列为5'-CTGCTCTCAATGCTGCAAGA-3'，下游引物序列为5'-TCGCAAGAGTCAATGCTGTC-3'；IGF1R 的上游引物序列为5'-TCGACATCCGCAACGACTATC-3'，下游引物序列为5'-CCAGGGCGTAGTTGTAGAAGAG-3'；β-actin 的上游引物序列为5'-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3'，下游引物序列为5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3'。

2.5 Western blot 实验 根据之前的研究进行Western blot［11］。裂解肿瘤细胞和组织，除去细胞碎片。用补充有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的TPER 组织蛋白提取试剂（Pierce）来制备细胞或组织裂解物。Western blot实验中IGF1R 抑制剂处理的条件 为 HCT116-Rab11-FIP4 细 胞 用 NVP-AEW541（5 μmol/L）处理12 h。用二辛可宁试验试剂盒（Pierce）测定蛋白质浓度。在10%SDS-PAGE 上分离60～80 μg 总蛋白质/样品，并将其固定在硝酸纤维素膜上。然后用5%脱脂牛奶在室温下封闭硝酸纤维素膜约2 h。加入 I 抗［Rab11-FIP4（1∶1 000），Rab11（1∶1 000），HIF-1α（1∶1 000），IGF1R（1∶1 000），p-ERK1/2（1∶1 000），ERK1/2（1∶1 500），p-AKT（1∶1 000），AKT（1∶1 500），β-actin（1∶3 000），均购自Santa Cruz］在4℃下孵育过夜。随后与辣根过氧化物酶缀合的II 抗（1∶5 000）在室温下温育1 h。使用增强的化学发光试剂显色条带。Image Lab 4.1 软件（Bio-Rad）用于条带的图像采集和光密度分析。

2.6 免疫共沉淀 使用Pierce®Co-IP 试剂盒进行免疫共沉淀分析。将抗Rab11-FIP4 的抗体（1∶50；Novus Biologicals）在室温下固定在氨基连接臂加偶联树脂。使用对照树脂来防止非特异性结合，随后将细胞裂解物加入到含有固定的抗体树脂的离心柱中，并在4℃孵育过夜。然后使用温和的洗脱缓冲液使相互作用的蛋白与固定的抗体分离。

2.7 双萤光素酶报告基因检测 使用双萤光素酶报告基因测定法（Promega）检测萤光素酶活性。将HCT116 细胞铺在96 孔板中。在HCT116 细胞中，用pCMV-HIF1α（每孔200 ng）或pCMV-载体（每孔200 ng）和pRL-TK（每孔6 ng；海肾萤光素酶）共转染截短的Rab11-FIP4启动子的pGL3构建体（萤火虫萤光素酶）。将pGL3的空质粒定义为pGL3-Basic。pGL3和pRL-TK 载体购自Promega。pCMV 载体购自Addgene。转染后6 h 用PBS 洗涤平板并用新鲜培养基替换。然后使用双荧光素酶报告分析系统测量转染48 h 后的萤火虫和海肾萤光素酶活性。将萤火虫萤光素酶活性标准化为海肾萤光素酶活性。

2.8 细胞活力测定 采用CCK-8 试剂（Dojindo Molecular Technologies）检测结直肠癌细胞的活力。将细胞（每孔4×103）接种于96孔培养板中，然后在37℃培养0、24、48和72 h后加入CCK-8试剂，最终使用酶标仪（BioTek Instruments）测定450 nm吸光度（A）值。

2.9 平板集落形成实验 将LoVo 和HCT116 细胞（每孔800 个）接种到单独的6 孔板中，共孵育8 d，并且培养液每2 d更换1次。此后，细胞用PBS洗涤，在37℃下用4%多聚甲醛固定15 min，并用1%结晶紫溶液染色5 min。使用光学显微镜（×400）计数大于50个细胞的集落。

2.10 细胞迁移和侵袭实验 （1）迁移实验:将Transwell 小室（8 μm；BD Biosciences）置于 24 孔板中。将结直肠癌细胞重悬于无血清培养液中，以每孔2×104个的密度加入Transwell小室上室内，向下室加入含有15%FBS 的培养液。温育20 h后，用1%结晶紫染色迁移的结直肠癌细胞5 min，在200 倍CKX41 光学显微镜下计数迁移细胞。每组实验设3个复孔，重复3 次计数迁移细胞的平均数。（2）侵袭实验:将结直肠癌细胞重悬于无血清培养液中，以每孔4×104个的密度加入预先铺好的Matrigel（BD Biosciences）的Transwell 小室上室内，向下室加入含有15% FBS 的培养液。温育36 h 后，将侵袭的细胞染色，成像并计数，每组实验设3 个复孔，重复3 次，计数侵袭细胞的平均数。迁移和侵袭实验中抑制剂处理组条件为:分别用 ERK 抑制剂U0126（5 μmol/L）或 AKT 抑 制 剂 LY294002（10 μmol/L）预 处 理HCT116-Rab11-FIP4细胞6 h。

2.11 人类磷酸激酶阵列测定 依照说明书（R&D Systems）将 HCT116-载体或 HCT116-Rab11-FIP4 细胞用于磷酸激酶阵列测定中。简言之，将细胞裂解物（800 μg）与阵列缓冲液混合，在4℃下与预封闭阵列膜孵育过夜。清洗膜后与I 抗在37℃下孵育2 h，然后洗涤（采用洗涤缓冲液洗涤5 min、3 次），再与II抗在37℃下孵育30 min，再次洗涤膜并进行化学发光检测。

3 统计学处理

使用GraphPad Prism 5.0 软件分析本研究中的所有数据。数据用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，然后用Tukey检验。总生存时间由Kaplan-Meier法确定，并用对数秩检验进行比较。Rab11-FIP4 与HIF-1α 的相关性采用Pearson 相关分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1 Rab11-FIP4 在结直肠癌组织中表达上调，且其高表达与结直肠癌患者的预后不良有关

免疫组化分析显示，在结直肠癌的临床样本中，大多数Rab11-FIP4分布于结直肠癌细胞的细胞质和膜中，见图1A；结直肠癌组织中Rab11-FIP4 的表达水平显著高于相应的非癌组织（P＜0.01），见图1B、C。RT-qPCR 分析结果类似，见图1D。此外，根据免疫组化染色评分结果将结直肠癌患者分为Rab11-FIP4 高表达组（n=61）和 Rab11-FIP4 低表达组（n=39）。Kaplan-Meier 生存分析显示，与 Rab11-FIP4 低表达组相比，Rab11-FIP4 高表达组的总生存时间缩短（P＜0.05），复发率升高（P＜0.05），见图1E、F。本研究所包含的结直肠癌患者的临床和病理特征见表1。

Figure 1.High expression of Rab11-FIP4 predicted poor prognosis in patients with colorectal cancer（CRC）.A:representative immunohistochemistry（IHC）images of Rab11-FIP4 expression.B:IA values of IHC analysis for Rab11-FIP4 expression in 40 paired samples from CRC patients.Mean±SD. n=40.**P＜0.01 vs non-tumorous（NT）group.C:the similar trend was observed in fold change of the Rab11-FIP4 A values in 40 paired samples from CRC patients.D:50 paires of CRC tissues and correspongding NT tissues detected by RT-qPCR revealed that the mRNA level of Rab11-FIP4 in CRC group was increased compared with NT group.β-actin was used as loading control.Mean±SD. n=50.**P＜0.01 vs NT group.E，F:Kaplan-Meier analysis showed that the patients in high Rab11-FIP4 group（n=61）had reduced overall survival time and a higher tendency for CRC recurrence compared with low Rab11-FIP4 group（n=39）.图1 Rab11-FIP4高表达预示结直肠癌患者预后不良

2 Rab11-FIP4 的过表达促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

RT-qPCR 和Western blot 分析的结果显示，在用慢病毒感染的HCT116 和LoVo 细胞中，Rab11-FIP4的 mRNA 和蛋白质水平显著升高（P＜0.01），见图2A、B。CCK-8 法和集落形成实验显示Rab11-FIP4的过表达提高了结直肠癌细胞的活力（P＜0.05）和集落形成数量（P＜0.05），见图2C、D。Transwell 实验显示Rab11-FIP4高表达显著增加了HCT116和LoVo细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05），见图2E、F。

3 Rab11-FIP4 过表达通过 IGF1R 增加 ERK1/2 和AKT的磷酸化，促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭

Western blot 分 析 显 示 ，HCT116 细 胞 过 表 达Rab11-FIP4 后，IGF1R 蛋白水平上调，见图3A。然而，HCT116 细胞中Rab11-FIP4 的过表达未引起IGF1R mRNA 水平的相应增加（P＞0.05），见图3B。使用Rab11-FIP4 过表达的HCT116 细胞和相应的对照细胞进行免疫共沉淀测定显示，Rab11-FIP4 与Rab11 和 IGF1R 形成复合物，并且 Rab11-FIP4 的过表达增加了HCT116 细胞中该复合物的形成，见图3C。此外，采用人类磷酸激酶阵列测定显示在HCT116 细 胞 中 Rab11-FIP4 过 表 达 后 ，ERK1/2 和AKT 的磷酸化水平增加（P＜0.05），见图3D；Western blot 实验也证实了这一结果但用IGF1R 抑制剂处理HCT116 细胞后，p-ERK1/2 和 p-AKT 水平降低，见图3E。再分别用ERK1/2 和AKT 抑制剂处理稳定过表达Rab11-FIP4 的HCT116 细胞后显示，与用ERK1/2和AKT 未处理的细胞相比，抑制剂处理的结直肠癌细胞迁移和侵袭能力显著降低（P＜0.05），见图3F、G。

表1 结直肠癌患者临床和病理特征Table 1.Clinical and pathological characteristics of colorectal cancer patients

4 缺氧通过诱导结直肠癌细胞中HIF-1α 高表达从而引起Rab11-FIP4的表达上调

Western blot结果表明，与相应的非癌组织相比，结直肠癌组织中Rab11-FIP4 和HIF-1α 的表达增加，而且HIF-1α 高表达的组织表现出相应的Rab11-FIP4 高表达，见图4A。对100 例结直肠癌样品进行Rab11-FIP4 表达免疫组化分析，并结合其组织芯片中HIF-1α 的表达积分光密度值，显示Rab11-FIP4 与HIF-1α 的表达之间存在显著的正相关，见图4B。另外，在缺氧条件下Rab11-FIP4 的mRNA 和蛋白水平显著增加，见图4C、D。进一步使用双萤光素酶报告基因测定，显示Rab11-FIP4 的转录起始位点4 个公认的缺氧反应元件（hypoxia response element，HRE）中，HRE3 位点的缺失显著降低了HIF-1α 诱导的Rab11-FIP4启动子活性（P＜0.01），见图4E。

讨 论

恶性肿瘤侵袭和远处转移（可能是由于癌基因活性上调或抑癌基因活性丧失所致）是包括结直肠癌在内的大多数恶性肿瘤患者死亡率升高的主要原因［4］。由于出现远处转移，接受手术切除或化疗的结直肠癌患者的生存率仍然较低［5］。到目前为止，导致结直肠癌转移的关键因素尚未确定。本研究显示，与相应的非癌组织相比，结直肠癌组织中Rab11-FIP4 的表达水平显著升高，并且Rab11-FIP4 高表达导致结直肠癌患者总生存时间和复发时间缩短；Rab11-FIP4 的高表达促进了结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移。因此，该研究提示了Rab11-FIP4可能是一个促使结直肠癌进展的癌基因，并且Rab11-FIP4 有可能成为预测结直肠癌患者预后的生物标志物。

Figure 2.Overexpression of Rab11-FIP4 promoted proliferation，migration and invasion of colorectal cancer（CRC）cells.RT-qPCR（A）and Western blot（B）were used to detect lentiviral-mediated Rab11-FIP4 expression levels in HCT116 and LoVo cells.CCK-8 assay（C）and colony formation assay（D）revealed that up-regulation of Rab11-FIP4 expression enhanced the proliferation ability of CRC cells.Transwell assays showed that Rab11-FIP4 overexpression promoted migration（E）and invasion（F）of CRC cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P ＜0.01 vs vector group.图2 Rab11-FIP4的过表达促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

Rab11 小 G 蛋白（Rab11a、Rab11b 和 Rab25）是Ras 超家族的成员，具有高度的序列同一性，是受体和黏附蛋白表面表达的调节因子。大量的研究表明Rab11可以调节多种受体和黏附蛋白的转运，包括视紫红质、表皮生长因子受体、Toll样受体4、α5β1整合素、E-钙黏蛋白和 N-钙黏蛋白［13］。Rab11 直接与肌球蛋白Vb（myosin Vb，MyoVb）球状尾部结构域结合，而MyoVb 的C 端与Rab11 相互作用蛋白家族（Rab11 family interacting proteins，Rab11-FIPs）结合。Rab11-FIPs 包 括 Rip11、Rab11-FIP1、Rab11-FIP2、Rab11-FIP3、RCP 和 Rab11-FIP4，在之前已经被证明是多个Rab 和ADP-核糖基化因子GTPases 的调节因子［8］。Lall 等［14］认为，所有的 Rab11-FIPs 都与 Rab14和I类FIPs（RCP、FIP2 和Rip11）相互作用，而不与II类FIPs（FIP3 和FIP4）相互作用。有研究证明FIP2和FIP3 的RBD 与Rab11 可以形成复合物，从而组成具有两两对称的异四聚体结构［15-17］。本研究显示Rab11-FIP4 的表达上调显著增加了IGF1R 的蛋白水平，但不影响IGF1R mRNA 水平。该研究证明了Rab11-FIP4 可以与 Rab11 和 IGF1R 形成复合物，并且Rab11-FIP4 在HCT116 细胞中高表达增加了该复合物的形成。然而这一过程的确切生物、生理和细胞机制尚未明确。

分子和临床证据表明胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）/IGF1R 系统（包括 IGF，IGF1R和IGF结合蛋白）与实体肿瘤的增殖、分化、迁移，侵袭和血管生成有关。IGF1R 通常在结直肠癌组织中过度表达和激活，并参与结直肠癌的进展和转移［18］。通过与其配体 IGF1 或 IGF2 结合，IGF1R 的内在酪氨酸激酶活性被激活，导致其自磷酸化，并随后激活AKT 和丝裂原活化蛋白激酶途径［19-20］。有研究报道在肝癌细胞中干扰IGF1R 表达，可引起PI3K/AKT 和 MAPK 信号通路中 AKT 和 ERK1/2 的磷酸化水平显著降低［21］。在本次研究中我们发现Rab11-FIP4 通过 IGF1R 调节 ERK1/2 和 AKT 信号通路的磷酸化从而促进结直肠癌的迁移和侵袭过程。

Figure 3.Overexpression of Rab11-FIP4 promoted migration and invasion of colorectal cancer cells through IGF1R-mediated phosphorylation of ERK1/2 and AKT.A:Rab11-FIP4 overexpression in HCT116 cells up-regulated the protein level of IGF1R；B:RT-qPCR analysis showed that Rab11-FIP4 overexpression had no effect on the mRNA level of IGF1R；C:coimmunoprecipitation results demonstrated that Rab11-FIP4 interacted with Rab11 and IGF1R；D:Rab11-FIP4 overexpression increased the phosphorylation of ERK1/2 and AKT（detected by phosphokinase assay，fold change ≥2.0）；E:the protein levels of p-ERK1/2 and p-AKT were reduced following IGF1R inhibitor treament in HCT116-Rab11-FIP4 cells；F，G:HCT116-Rab11-FIP4 cells treated with either ERK inhibitor or AKT inhibitor had significantly reduced migration and invasion abilities.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Rab11-FIP4 group.图3 Rab11-FIP4的过表达通过IGF1R介导ERK1/2和AKT的磷酸化促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭

实体肿瘤的快速生长造成了缺氧的微环境，促进了肿瘤的血管生成和转移。HIF-1α通过缺氧微环境稳定并诱导一系列参与结直肠癌转移的靶基因表达［22］。研究表明，在肝细胞癌中Rab11-FIP4是 HIF-1α 的直接靶基因［10］。本研究显示 Rab11-FIP4 和HIF-1α 在结直肠癌组织中的表达存在显著的正相关，在缺氧条件下，Rab11-FIP4 和 HIF-1α 的表达水平显著增加。本研究还证实HIF-1α 可通过直接结合启动子上的HRE 位点从而诱导Rab11-FIP4 转录。这些结果提示在结直肠癌细胞中Rab11-FIP4也是HIF-1α 的靶基因。我们推测在缺氧微环境下，HIF-1α 通过 Rab11-FIP4/IGF1R/ERK1/2 及 AKT 信号通路促进结直肠癌发生发展。因此，本项工作的结果为结直肠癌发生发展中缺氧介导的信号转导机制及Rab11-FIP4 可能是结直肠癌治疗的潜在靶标提供了参考资料。