IGF-1R-Stat3信号通路通过激活中期因子表达促进肝癌细胞活力、迁移和侵袭*

陈埏芳， 冯淑芬， 施 颖， 钟 绿， 李观宏， 汤绍辉

（暨南大学附属第一医院消化科，广东广州510630）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌中最常见的病理类型，是世界上第五大常见恶性肿瘤，也是肿瘤死亡的第三大原因［1］。虽然近年来HCC 的诊疗水平有所提高，但我国HCC 患者的5年生存率仅约12%［2］。复发和转移是导致HCC患者死亡的两大主因。因此，研究HCC 发生和转移的分子机制，对HCC的个体化精准治疗极其重要。

胰岛素样生长因子1 受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）是一种广泛表达于多种类型细胞表面的酪氨酸激酶跨膜蛋白，主要介导IGF-1和IGF-2 的生物学作用，参与机体物质代谢调节、细胞增殖分化及胚胎发育等生物学过程［3-4］。近年研究表明，IGF-1R 在多种恶性肿瘤（包括HCC）中表达水平显著增高，IGF-1R过表达促进肝癌细胞生长、侵袭与转移，抑制IGF-1R 表达可能成为HCC 治疗的新靶点［5-7］。但是，目前有关IGF-1R调控HCC生长与侵袭转移的机制尚未完全明确。

IGF-1R 致癌的分子机制涉及Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导及转录激活蛋白（signal transducers and activators of transcription，Stat）信号通路的异常活化［8-11］。Stat3 蛋白属于 Stat 家族成员，研究显示Stat3 的激活可以促进HCC 发生和肿瘤血管形成，与HCC 的进展和预后密切相关［12］。但是目前对IGF-1R-Stat3 通路的研究尚不够深入，活化状态的Stat3调节下游靶基因的中间环节并不明确［8-11］。

我们前期研究显示，IGF-1R 通过正向调控中期因子（midkine）表达促进HCC 生长与侵袭，而抑制midkine 表达则可以逆转IGF-1R 对HCC 生长及侵袭的促进作用［7］。但是，IGF-1R 调控 midkine 表达的机制目前国内外尚缺乏系统深入研究。因此，我们对肝癌细胞中IGF-1R-Stat3信号通路与midkine表达调控的关系进行了初步探讨，以期为HCC 分子靶向治疗提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 临床标本收集 32例HCC 组织标本（男25例，女 7 例，平均年龄 52.6 岁）、32 例配对癌旁肝组织（matched adjacent nontumorous tissues，MANT）标本（术中切除距离肝癌病灶≥2 cm）和13 例正常成人肝组织（normal adult liver tissues，NALT）标本（男10例，女3例，11例为外伤性肝破裂患者，2例为肝血管瘤患者）于 2006 年 1 月至 2017 年12 月收集于暨南大学附属第一医院。所有患者的诊断均通过病理证实。组织标本离体后立即放入液氮中速冻后转入超低温冰箱存放。本研究由暨南大学附属第一医院医学伦理委员会批准。

1.2 细胞株 肝癌细胞株（Huh7 和Hep3B）和正常肝细胞株（HL-7702）购于ATCC。稳定敲减IGF-1R表达的Huh7 细胞株及midkine 表达载体已由本课题组前期构建并保存［7］。

1.3 主要试剂 小量质粒抽提试剂盒购于北京全式金生物公司；Lipofectamine™2000 转染试剂购于Invitrogen；抗Stat3、磷酸化Stat3（phosphorylated Stat3，p-Stat3）和GAPDH 兔单克隆抗体及抗兔IgG（H+L）生物素化抗体购于Cell Signaling Technology；抗midkine 兔单克隆［EP1143Y］抗体购于Abcam；MTT 检测试剂盒购于Abcam；Transwell 细胞培养板购于BD。

2 方法

2.1 RT-qPCR 实验 采用TRIzol 试剂盒制备各细胞株及肝组织标本总RNA，验证总RNA 抽提完整后，逆转录合成cDNA 并进行实时荧光定量PCR 分析。采用相对定量法（2-ΔΔCt）表示目的基因表达量。以18S rRNA 作为内参照。引物由苏州金唯智公司合成。IGF-1R 的上游引物序列为5'-GGTGTC-CAATAACTACATTG-3'，下游引物序列为5'-CAGCGGTTTGTGGTCCAGC-3'；Stat3 的上游引物序列为5'-CATCTTGAGCACTAAGCCT-3'，下游引物序列为5'-GAGATAGACCAGTGGAGACA-3'；midkine的上游引物序列为5'-CTGGGGTGCGTGTGATGGGG-3'，下游引物序列为5'-CTTTGGTCTTGGGGGTGCAG-3'；18S rRNA 的上游引物序列为5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'，下游引物序列为5'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3'。

2.2 Western blot 检测 Stat3、p-Stat3 和 midkine 的蛋白水平 用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，4℃离心，收集上清，采用BCA法测定蛋白浓度，将待测样品上样后进行电泳。电泳至PVDF膜后封闭，加入Ⅰ抗和Ⅱ抗。ECL 显色试剂盒进行显色，用凝胶成像仪进行拍照，以GAPDH为内参照，分析蛋白表达水平。

2.3 筛选针对Stat3的siRNA（siStat3） 通过查询GenBank 中人 Stat3 mRNA 序列（NM_139276.2），根据 siRNA 设计原则，设计 3 对 siRNA（Stat3_001、Stat3_002 和Stat3_003）及1 对无任何靶基因的阴性对照siRNA（negative control siRNA，NC siRNA），并委托苏州金唯智公司合成，序列见表1。培养Huh7细胞至汇合度为30%～50%，采用Lipofectamine ™2000转染试剂转染siRNA。实验分为4组，即阴性对照组（NC siRNA）和3 个实验组（Stat3_001、Stat3_002和Stat3_003），每组设置3 个siRNA 浓度梯度（25、50和 100 nmol/L）。转染 24 h 后，按 TRIzol 试剂盒说明抽提Huh7 细胞总RNA，逆转录合成cDNA 并进行定量 PCR 扩增，测定 Stat3 的 mRNA 表达量，引物序列同前。每个样本同时扩增3个复管，并连续进行3次实验。采用2-ΔΔCt表示目的基因表达量。

表1 Stat3 siRNA候选序列Table 1.Candidate sequences of Stat3 siRNA

2.4 IGF-1R 和Stat3 过表达载体的构建 提取Hun7细胞总RNA进行反转录。以反转录产物cDNA为模板，PCR 扩增。PCR 条件为:94℃ 5 min；98℃30 s，58℃ 30 s，68℃ 20 s，30 个循环；68℃下延伸5 min；16℃保存。引物由苏州金唯智公司合成。IGF-1R 的上游引物序列为5'-ccggaattcgccaccATGAAGTCTGGCTCCGGAGGAG-3'，下游引物序列为5'-ctagtctagaTCAGCAGGTCGAAGACTGGGG-3'；Stat3的上游引物序列为5'-GATCCGCTTCAGACCCGTCAACAAACTCGAGTTTGTTGACGGGTCTGAAGTTTTTTG-3'，下游引物序列为5'-AATTCAAAAAACTTCAGACCCGTCAACAAACTCGAGTTTGTTGACGGGTCTGAAGCG-3'。在上、下游分别引入EcoRI 与XbaI 的酶切位点及保护性碱基。用EcoRI 和XbaI 双酶切质粒载体pcDNA3.1和PCR扩增得到的目的基因，分别收集目的片段后使用T4 连接酶进行连接，构建重组质粒，并进行酶切鉴定和送至苏州金唯智基因公司进行测序鉴定。

2.5 MTT 法检测细胞活力 实验分为5 组:空白对照（blank control，Bla）组（未转染的Huh7细胞）、IGF-1R 组（瞬时转染IGF-1R 过表达质粒的Huh7 细胞）、siStat3+midkine 组（瞬时共转染 siStat3 及 midkine 过表达质粒的Huh7细胞）、shIGF-1R 组（稳定敲减IGF-1R表达的Huh7 细胞）和shIGF-1R+Stat3 组（稳定敲减IGF-1R表达的Huh7 细胞瞬时转染Stat3 过表达质粒）。取上述5 组细胞，调整密度为1×108/L，接种至96 孔板，每孔加入 100 μL DMEM 培养液，于 37℃、5%CO2培养箱中培养细胞，待贴壁后收集各时点（0、24、48和72 h）细胞，加入MTT，孵育4 h后，用酶标仪在波长570 nm处读取吸光度。

2.6 Transwell 实验检测细胞迁移及侵袭能力 在细胞迁移实验中，取上述5 组细胞，计数1×105个细胞，取100 μL 细胞悬液接种于Transwell 小室的上室，下室中加入600 μL 完全培养液，在37℃、5%CO2培养箱孵育12～48 h。取出Transwell 小室，弃培养液，用棉签擦去上室内的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 洗涤 1 次，用结晶紫染色 10 min，再用 PBS洗涤1 次，显微镜下观察5 个高倍视野计数，拍照统计结果。检测细胞侵袭能力时，取Matrigel 加入Transwell 小室中，37℃孵育 2 h 使Matrigel 凝固，余下步骤同迁移实验。

3 统计学处理

用SPSS 23.0 软件进行统计分析，用GraghPad Prism 7 软件作图。每次实验重复3 次，记录平均值。计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，两变量相关性评估采用Pearson 积矩相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 HCC 细胞株及组织中 IGF-1R、Stat3 和 midkine mRNA表达水平上调

RT-qPCR 结果显示，Huh7 和 Hep3B 细胞中 IGF-1R、Stat3 和 midkine 的 mRNA 表达水平均显著高于HL-7702 细胞（P＜0.01），见图1A；HCC 组织中IGF-1R、Stat3 和 midkine 的 mRNA 表达水平均显著高于MANT 及 NALT（P＜0.01），MANT 中 IGF-1R mRNA表达水平也显著高于NALT（P＜0.05），见图1B。线性相关分析结果进一步显示，HCC 组织中Stat3 和midkine mRNA 表达水平均与IGF-1R mRNA 表达水平呈正相关（r=0.716 和r=0.681，P＜0.01），midkine mRNA 表达水平与Stat3 mRNA 表达也呈正相关（r=0.657，P＜0.01），见图1C。

Figure 1.The mRNA expression of IGF-1R，Stat3 and midkine was up-regulated in HCC cell lines and tissues.A:the mRNA expression of IGF-1R，Stat3 and midkine in HCC cell lines（Huh7 and Hep3B）and normal liver cell line（HL-7702）was detected by RT-qPCR（n=3）；B:the mRNA expression of IGF-1R，Stat3 and midkine in human HCC tissues（n=32），matched adjacent nontumorous tissues（MANT，n=32）and normal adult liver tissues（NALT，n=13）was detected by RT-qPCR；C:linear correlation analyses among IGF-1R，Stat3 and midkine mRNA expression levels in HCC tissues（n=32）.Mean±SD.**P＜0.01 vs HL-7702 group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs NALT group；##P＜0.01 vs MANT group.图1 IGF-1R、Stat3和midkine在HCC细胞株和组织中的mRNA表达水平上调

2 siStat3的筛选结果

siStat3 转染 Huh7 细胞后，RT-qPCR 检测转染效果，结果显示，转染 Stat3_001、Stat3_002 及Stat3_003的Huh7 细胞中Stat3 mRNA 表达量均有不同程度的降低，抑制效率约为37%～80%，其中Stat3_003 浓度在100 nmol/L 时抑制效率最高，达80%，见表2。因此采用此siRNA用于后续研究。

3 IGF-1R 通过上调Huh7 细胞Stat3 表达并增加其磷酸化水平而促进midkine表达

RT-qPCR 结果显示，与空白对照组相比，瞬时上调 IGF-1R 表达，Stat3 和 midkine 的 mRNA 表达水平显著上调（P＜0.01），见图2A；Western blot 结果显示，瞬时上调 IGF-1R 表达后 Stat3、p-Stat3 及 midkine的蛋白水平也显著上调，见图2B。

表2 针对Stat3的siRNA筛选结果Table 2.Results of siRNA screening for Stat3

稳定敲减IGF-1R表达则可显著降低Stat3 和midkine 的mRNA 表达水平（P＜0.01）及Stat3、p-Stat3和midkine的蛋白水平，见图2A、B。

在稳定敲减IGF-1R表达的Huh7细胞中，瞬时上调Stat3 表达逆转了敲减IGF-1R表达所致的midkine mRNA及蛋白表达水平降低（P＜0.01），见图2A、B。

在Huh7细胞中瞬时敲减Stat3表达，可下调midkine mRNA 及蛋白表达（P＜0.01），瞬时上调Stat3 表达则可上调midkine mRNA 及蛋白表达（P＜0.01），见图2C、D。

4 IGF-1R 通过激活 Stat3、上调 midkine 表达而增强Huh7细胞活力，促进其迁移和侵袭

MTT 法及 Transwell 实验结果显示，在 Huh7 细胞中瞬时上调IGF-1R 表达可显著增强其活力、迁移能力和侵袭能力（P＜0.01）；瞬时敲减Stat3表达并同时瞬时上调midkine 表达则其活力、迁移能力和侵袭能力无明显变化（P＞0.05）；而稳定敲减IGF-1R表达则显著抑制Huh7 细胞活力、迁移能力和侵袭能力（P＜0.01）；在稳定敲减IGF-1R表达的 Huh7 细胞中瞬时上调Stat3 表达可逆转敲减IGF-1R表达所致的细胞活力、迁移能力和侵袭能力的抑制（P＜0.01），见图3、4。

讨 论

IGF-1R 是IGF 家族中的一个重要成员。大量研究表明，IGF-1R 在多种恶性肿瘤包括HCC 中的表达水平显著上调，其致癌机制涉及多条信号通路活化，其中IGF-1R-Stat3 信号通路激活在HCC 发生中具有重要作用，但Stat3 信号的下游靶分子尚未完全明确［8-11］。

Stat3 是Stat 转录因子家族的一员，参与调控细胞增殖、分化、凋亡、血管生成、免疫反应、肿瘤发生和转移等病理生理过程［8，10，13-14］，而且对于细胞恶性转化的建立和维持至关重要［8，13］。此外，midkine 是一种肝素结合生长因子［15］，在胚胎发育过程中呈现高水平表达，但在正常成人组织表达水平极低［16-17］。最近研究表明，midkine 参与人类多种肿瘤（包括HCC）的发生发展［18-21］。

在本研究中，我们检测到IGF-1R、Stat3 和midkine 在 HCC 细胞株（Huh7 和 Hep3B）和 32 例人 HCC组织中的mRNA 表达水平显著升高；线性相关分析显示HCC 组织中Stat3 和midkine mRNA 的表达水平均与IGF-1R mRNA 表达水平呈正相关，midkine mRNA 表达水平也与Stat3 mRNA 表达水平呈正相关。这些结果表明，IGF-1R-Stat3 信号通路和midkine 表达在HCC 中被激活，且前者可能正向调控后者表达。与本研究结果相似，多项研究报道IGF-1R［5-7，22］、Stat3［23-24］及 midkine［25-26］在 HCC 中的表达水平显著上调。

为进一步明确IGF-1R-Stat3 信号通路与midkine表达之间的联系，我们在Huh7 肝癌细胞中进行了过表达或敲减IGF-1R和Stat3的体外细胞实验。结果显示，在 Huh 细胞中，IGF-1R 正向调控 Stat3 和 midkine 的 mRNA 表达水平及 Stat3、p-Stat3 和 midkine 的蛋白表达水平；在稳定敲减IGF-1R表达的Huh7细胞中，瞬时上调Stat3 表达逆转了敲减IGF-1R表达所致的midkine mRNA 及蛋白表达水平降低；在Huh7 细胞中瞬时上调或下调Stat3表达，则midkine 的mRNA和蛋白表达水平也出现了同向变化。上述结果表明，在 HCC 细胞中，IGF-1R 通过上调 Stat3 表达并增加其磷酸化水平促进midkine表达；结合前述HCC组织中IGF-1R、Stat3 和midkine 表达的线性相关分析结果，表明IGF-1R-Stat3 信号通路正向调控midkine表达。

为了探讨IGF-1R-Stat3信号通路影响midkine 表达对HCC细胞生物学行为的影响，我们在Huh7细胞中过表达或敲减IGF-1R和Stat3及上调midkine 表达后观察细胞活力、迁移能力和侵袭能力的变化。结果显示，在Huh7 细胞中瞬时上调IGF-1R 表达可显著增强其活力、迁移能力和侵袭能力；瞬时敲减Stat3表达并同时瞬时上调midkine 表达则其活力、迁移能力和侵袭能力无明显变化；而稳定敲减IGF-1R表达则显著抑制Huh-7 细胞活力、迁移能力和侵袭能力；在稳定敲减IGF-1R表达的Huh7 细胞中，瞬时上调Stat3 表达可逆转敲减IGF-1R表达所致的细胞活力、迁移能力和侵袭能力的抑制。

Figure 2.Effect of IGF-1R on the expression of Stat3 and midkine（A，B），and effect of Stat3 on midkine expression（C，D）in Huh7 cells.The mRNA expression of Stat3 and midkine was detected by RT-qPCR（A，C），and the protein levels of Stat3，p-Stat3 and midkine were detected by Western blot（B，D）.Bla:blank control；shIGF-1R:stable knockdown of IGF-1R；IGF-1R:transient over-expression of IGF-1R；Stat3:transient over-expression of Stat3；siStat3:transient knock-down of Stat3.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Bla group；##P＜0.01 vs shIGF-1R group.图2 IGF-1R对Huh7细胞Stat3和midkine表达水平及Stat3对Huh7细胞midkine表达水平的影响

Figure 3.Effect of IGF-1R-Stat3 signaling pathway and midkine expression changes on Huh7 cell viability.Bla:blank control；IGF-1R:transient over-expression of IGF-1R；siStat3+midkine:transient knock-down of Stat3 and transient over-expression of midkine；shIGF-1R:stable knockdown of IGF-1R；shIGF-1R+Stat3:stable knockdown of IGF-1R and transient over-expression of Stat3.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Bla group；##P＜0.01 vs shIGF-1R group.图3 IGF-1R-Stat3信号通路及midkine表达改变对Huh7细胞活力的影响

Figure 4.Effect of IGF-1R-Stat3 signaling pathway and midkine expression changes on Huh7 cell migration（A）and invasion（B）.Scale bar=50 μm.Bla:blank control；IGF-1R:transient over-expression of IGF-1R；siStat3+midkine:transient knockdown of Stat3 and transient over-expression of midkine；shIGF-1R:stable knockdown of IGF-1R；shIGF-1R+Stat3:stable knockdown of IGF-1R and transient over-expression of Stat3.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Bla group；#P＜0.05 vs shIGF-1R group.图4 IGF-1R-Stat3通路及midkine表达改变对Huh7细胞迁移和侵袭的影响

综上所述，本研究结果提示，IGF-1R-Stat3 信号通路通过激活midkine表达增强HCC细胞活力，促进其迁移和侵袭，而抑制该通路激活则显著降低HCC细胞的活力、迁移能力和侵袭能力。