脑梗死大鼠脑水肿程度的磁共振DTI序列评估

张 勇，程敬亮，郑瑞平，吕青青，汪卫建

郑州大学第一附属医院磁共振科 郑州 450052

脑卒中主要包括缺血性卒中(也叫脑梗死)和出血性卒中，前者的发病率高于后者，占卒中总数的90%[1]。脑梗死发病率高、致残率高、病死率高，已成为全球死亡的主要原因之一[2-3]。磁共振弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是DWI技术的延伸及进一步发展，它基于水分子的布朗运动，定量分析水分子在不同方向上的各向异性，从而进行空间成像，将神经纤维束的走行及改变进行可视化，可以更加直观、准确地观察组织结构细微变化，描述病变。我们利用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠模型模拟脑梗死后脑水肿的形成及发展过程，利用扩散参数进行定量评估，并分析DWI参数反映脑水肿程度的AQP-4蛋白表达水平及反映神经功能受损程度指标mNSS的关系，探讨DWI动态监测脑梗死损伤程度的价值。

1 材料与方法

1.1动物及分组清洁级健康成年SD雄性大鼠100只，体重270～300 g，由河南省实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(豫)2015-0004。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、MCAO模型组，每组50只。

1.2大鼠MCAO模型的制作大鼠禁食12 h，给予适量清洁饮水，然后参照文献[4]方法利用线栓法制备MCAO模型。大鼠术后清醒恢复意识后，左侧肢体出现Horner征，右前肢屈曲内收且无法完全伸展，向右侧转圈并追尾，证明MCAO模型制作成功。假手术组大鼠线栓只插入颈内动脉，不插入大脑中动脉。术后注意保温，密切观察并记录大鼠的生命体征和行为学改变。

1.3大鼠神经功能评分(mNSS)分别在线栓成功插入术后的1、3、6、12、24 h对两组大鼠进行mNSS测定，方法参考文献[4]评分准则。每个时间点10只大鼠。

1.4大鼠脑梗死区ADC、FA值的测定采用美国GE Discovery MR 750 3.0T磁共振扫描仪进行扫描。mNSS评分后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，行T1WI、T2WI、DWI、DTI序列检查，经医学数字成像输入至后处理站。打开Functool工具包，点击DTI后处理页面，分别在ADC、FA图上的梗死区(假手术组在对应区域)选取约4 mm2大小的感兴趣区测量ADC及FA值，每个梗死区分别测量3次，结果取平均值。

1.5梗死区脑组织中AQP-4蛋白表达的免疫组化法检测磁共振扫描完成后，取梗死区脑组织，制作石蜡切片(厚度约4 μm)。采用SP免疫组化法检测AQP-4蛋白,AQP-4抗体为山羊抗兔IgG,购自Abcam公司，以已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。AQP-4阳性表达细胞胞浆呈黄色。显微镜下每张切片选取5个200倍视野，采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统测定平均光密度值，代表AQP-4蛋白的相对表达量。

1.6统计学处理采用SPSS 22.0进行统计学处理。两组间mNSS、FA值、ADC值、AQP-4蛋白相对表达量的比较采用2×5析因设计的方差分析；对MCAO模型组大鼠各指标间的关系进行Pearson相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1两组大鼠的神经功能改变假手术组大鼠无神经功能受损症状，mNSS不随时间变化;而MCAO模型组大鼠随着时间的延长，mNSS逐渐增加，且均大于假手术组(表1)。

表1 两组大鼠mNSS的比较(n=10)

2.2两组大鼠脑梗死区ADC、FA值的变化假手术组各时间点ADC、FA值比较，差异无统计学意义。与假手术组相比，MCAO模型组大鼠各时间点ADC、FA值均降低，在12 h时达最低，而后上升(表2、3)。

表2 两组大鼠脑梗死区ADC值的比较(n=10) ×10-4 mm2/s

表3 两组大鼠脑梗死区FA值的比较(n=10)

2.3两组大鼠梗死区脑组织中AQP-4蛋白的表达免疫组化结果显示，假手术组可见少量 AQP-4蛋白阳性表达细胞，并且着色较弱；MCAO模型组AQP-4蛋白阳性表达细胞随着梗死时间的延长逐渐增多(图1，表4)。

图1 两组大鼠不同时间点梗死区脑组织中AQP-4蛋白的表达(SP，×400)

表4 两组大鼠梗死区脑组织中AQP-4蛋白相对表达量的比较(n=10)

2.4MCAO模型组大鼠ADC值、FA值、AQP-4蛋白表达及mNSS之间的关系缺血后24 h，ADC及FA值与mNSS呈负相关，AQP-4蛋白表达与mNSS呈正相关，AQP-4蛋白表达与FA、ADC值呈负相关，ADC值与FA值呈正相关(表5)。

表5 MCAO模型组大鼠ADC值、FA值、AQP-4蛋白表达及mNSS间的相关性分析

3 讨论

脑梗死严重威胁着人们的健康，影响人们的生活质量。脑水肿是脑梗死致死的重要原因之一[5]。脑梗死后脑组织中的水分过度聚集，引发脑组织水肿，继而引起脑疝、颅内高压等症状而致人死亡。因此，中枢神经系统的水稳态具有重要意义。AQP是存在于人和高等哺乳动物质膜中的跨膜蛋白，其中AQP-4是大脑主要的水通道蛋白，在毛细血管周围的星形细胞足突中广泛表达。AQP-4蛋白在调节中枢神经系统水平衡中起着重要作用，其表达可以直观且定量地反映脑水肿程度，而脑水肿严重程度又影响着神经纤维束的完整性。

mNSS是对动物的运动功能、本体感觉等进行评估，可以反映神经功能的损伤程度[6]。本研究结果显示，随着梗死时间的延长，MCAO模型组大鼠mNSS逐渐增加，表明脑梗死大鼠的神经功能损伤程度逐渐加重。

DTI能追踪活体大脑纤维束的完整性，可以直观评价纤维束损伤程度。梗死灶形成后，脑微观结构受破坏，引起脑白质结构中的水分子各向异性减低，DTI上表现为FA值降低[7-8]，FA能够较为准确和灵敏地反映神经纤维束的完整性。ADC值可以定量评估活体受检组织中水分子的扩散情况。FA值较ADC值病变的检出率更高，不过二者的综合运用可用来区分细胞毒性和血管源性水肿[9-10]。因此，本文对DTI参数FA和ADC值与大鼠脑梗死后AQP-4蛋白表达及mNSS评分的关系进行分析。

作者发现，与假手术组相比，梗死后的每个时间点，MCAO模型组ADC值及FA值均明显降低，虽然12 h降至最低后逐渐回升，但是仍低于假手术组，表明脑梗死后神经纤维束的结构遭到了一定的破坏。ADC值在梗死后1～12 h逐渐降低，此时细胞毒性水肿占主导地位；12～24 h ADC值逐渐回升，可能与血管源性水肿逐渐加重有关。随着梗死时间的延长，梗死区脑组织AQP-4蛋白的表达逐渐增加，与之前的研究[11-14]一致。本研究中mNSS与AQP-4蛋白表达呈正相关，进一步说明了脑水肿程度与神经功能改变相关。AQP-4与ADC值及FA值呈负相关，这可能是由于AQP-4表达增加后通过降解基底膜而破坏血脑屏障，导致细胞毒性水肿和血管源性脑水肿，致使水分子扩散受限，ADC及FA值随之降低。因此ADC值与FA值低，说明大鼠脑水肿程度增加，神经功能受损严重。

总之，磁共振DTI序列可动态监测大鼠脑梗死区水肿程度和神经功能损伤程度，对临床判断脑水肿程度有重要意义。