甲状腺癌组织中肿瘤浸润免疫细胞模式与预后的关系

王 尧，巴宏军，柳子川，周 旻

1)广州医科大学附属肿瘤医院内科 广州 510095 2)中山大学附属第一医院心血管儿科 广州 510080

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，近几十年来全球的发病率明显增加[1]。虽然整体治疗效果较好，但仍有10%的患者预后极差，包括未分化、复发和转移性甲状腺癌[2]。近年来，免疫检查点抑制剂在多种肿瘤中取得了持久性疗效[3]。研究[4]发现肿瘤浸润免疫细胞(tumor-infiltrating immune cells, TIICs)的数量和分布可影响肿瘤患者的治疗反应，TIICs成为进一步提高患者生存率的潜在药物靶标。甲状腺癌的发生发展与炎症和免疫细胞浸润高度相关，探索其免疫浸润模式有助于判断患者的预后和治疗反应[5]。CIBERSORT分析工具能够利用标准化的基因表达数据估算不同肿瘤样本中的细胞组成，具有分辨率高及可同时量化多种类型免疫细胞的优势，其优越性能已在多种恶性肿瘤中得以验证[6]。本研究中，我们使用CIBERSORT分析甲状腺癌组织中TIICs的组成，并进一步探讨其与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1数据采集从癌症基因信息数据库(The Cancer Genome Atlas，TCGA)下载58例正常甲状腺和448例甲状腺癌患者的临床资料。资料采集时间(即随访截止时间)为2019年8月31日。正常甲状腺组织58例,男19例，女39例；年龄36～90(69.1±15.8)岁。甲状腺癌组织448例，男117例，女331例；年龄34～86(67.3±14.7)岁；TNM分期Ⅰ期258例，Ⅱ期47例，Ⅲ期97例，Ⅳ期46例。

1.2正常甲状腺和甲状腺癌组织中TIICs组成的CIBERSORT评估采用CIBERSORT分析工具(https://cibersort.stanford.edu)推算正常甲状腺和甲状腺癌组织中22种免疫细胞的组成。基因表达数据集使用标准注释文件编写，然后上传到CIBERSORT网站，利用白细胞特征矩阵(LM22)进行1 000次计算，使用蒙特卡罗抽样为每个样本的反褶积计算P值。

1.3免疫浸润模式的聚类分析为了分析甲状腺癌组织中免疫细胞比例与患者预后之间的关系，对所有样本进行分层和聚类，以确定是否可以根据22种TIICs来识别免疫细胞浸润模式。采用Ward方法对所有样本数据按照免疫细胞组成比例的不同进行聚类。将22种免疫细胞的比例调整为0～1之间，采用Elbow法和Gap统计量相结合的方法，分析数据中不同聚类的可能数量，通过K-means聚类法选取最佳的聚类中心(k=2)并将样本分为两组。

1.4统计学处理采用R软件(3.5.2版本)进行数据分析。正常甲状腺和甲状腺癌组织中TIICs比例的比较采用两独立样本的t检验；不同TNM分期甲状腺癌组织中TIICs比例的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。总生存期(overall survival, OS)定义为自确诊开始至任何原因引起死亡的时间间隔，通过Kaplan-Meier曲线分析TIICs与OS之间的关系，并采用log-rank法进行检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1正常甲状腺和甲状腺癌组织中TIICs的组成与比较结果见图1。正常甲状腺组织中含有丰富的未活化的记忆性CD4+T细胞[(23.10±2.30)%]、CD8+T细胞[(17.50±1.80)%]、M0巨噬细胞[(16.50±1.20)%]；活化的记忆性CD4+T细胞[(0.32±0.04)%]、活化的树突状细胞[(0.17±0.02)%]及中性粒细胞[(0.08±0.01)%]比例较低。甲状腺癌组织中含有丰富的M0巨噬细胞[(19.50±2.10)%]、未活化的记忆性CD4+T细胞[(14.20±1.30)%]、CD8+T细胞[(11.20±1.40)%]和M2巨噬细胞[(10.80±1.70)%]；活化的肥大细胞[(0.05±0.01)%]、中性粒细胞[(0.03±0.01)%]和嗜酸性粒细胞[(0.02±0.01)%]的比例较低；未发现幼稚CD4+T细胞。与正常甲状腺组织比较，甲状腺癌组织中M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、未活化的树突状细胞、活化的肥大细胞的比例较高，而CD8+T细胞、幼稚B细胞、滤泡辅助性T细胞的比例较低(图2)。

图1 正常甲状腺和甲状腺癌组织中22种TIICs的组成分布

图2 正常甲状腺与甲状腺癌组织中TIICs组成的差异

2.2甲状腺癌组织中TIICs与患者预后的关系甲状腺患者低比例的活化的肥大细胞(χ2=5.471，P=0.021)、中性粒细胞(χ2=6.724，P=0.016)及高比例的CD8+T细胞(χ2=7.133，P=0.015)与较长的OS有关(图3)。

图3 甲状腺癌组织中TIICs与患者预后的关系

随着肿瘤分期的增加，活化的树突状细胞、M0巨噬细胞及单核细胞比例逐渐增加，而CD8+T细胞比例逐渐下降(表1)。其他类型的TIICs比例与患者预后及肿瘤分期无关。

表1 不同TNM分期甲状腺癌组织中活化的树突状细胞、M0巨噬细胞、单核细胞、CD8+T细胞比例的比较%

2.3免疫状态与甲状腺癌预后的关系通过聚类分析将甲状腺癌患者分为高免疫组(176例)和低免疫组(272例)，两组中TIICs的分布情况见图4A，Kaplan-Meier生存曲线见图4B，高免疫组预后优于低免疫组(χ2=3.653，P=0.039)。

A：两组患者TIICs组成的分布；B：两组患者的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

肿瘤的发生、发展过程受宿主免疫系统的影响，在不同患者、肿瘤不同阶段或不同类型肿瘤之间TIICs分布均显著不同，通过对TIICs的数量、表型及空间分布进行评估可以为患者提供更加可靠的治疗策略[7]。本研究通过分析TCGA的基因表达数据，明确TIICs在甲状腺癌组织中的分布情况，并进一步分析TIICs与预后的关系。

肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)在不同病理亚型的甲状腺癌组织中有明显差异，高表达的TAMs与淋巴结转移、肿瘤负荷和不良生存密切相关[8]。TAMs可通过分泌IL-8提高甲状腺癌细胞的侵袭性[9]。本研究发现在甲状腺癌组织中M0和M2巨噬细胞相对于正常组织明显升高，提示它们在甲状腺癌的发生中发挥着重要作用。进一步研究发现M0巨噬细胞的比例随着肿瘤分期而增加，这反映了肿瘤发展过程中TIICs亚群的功能异质性，并提示M0巨噬细胞在甲状腺癌的发展中具有重要作用，其有可能成为潜在的治疗靶点。

鉴于肿瘤免疫特性而提出的“免疫评分”已成为判断肿瘤预后的新方法，主要基于对T细胞亚群尤其是CD3+T细胞和CD8+T细胞的评估[10]。既往研究[11]发现，甲状腺癌组织中CD8+T和CD4+T细胞以及B细胞与缩小的肿瘤体积具有相关性，而肿瘤浸润CD8+T细胞。本研究中发现在甲状腺癌组织中存在丰富的CD8+T细胞，但相对于正常组织却明显降低，高水平的CD8+T细胞与延长的OS密切相关，并且随肿瘤分期的增加CD8+T细胞比例逐渐下降。因此，我们认为CD8+T细胞对甲状腺具有保护作用，是判断患者预后的重要指标。

肥大细胞衍生介质如趋化因子CXCL1、CXCL10和CXCL8等能够促进肿瘤的生长和转移，在甲状腺癌组织中CXCL1和CXCL10能够促进细胞增殖，CXCL8可诱导肿瘤的干细胞特性或增强上皮间质转化[12]。本研究发现低水平的活化的肥大细胞与延长的OS具有相关性。因此靶向肥大细胞或抑制细胞因子和趋化因子的治疗有可能成为难治性甲状腺癌的新方法。

综上所述，本研究揭示了TIICs在甲状腺癌与正常组织间的分布差异及其在判断患者预后中的作用。TIICs在不同分期的甲状腺癌组织中组成的多样性表明免疫系统在甲状腺癌的发生发展中发挥着复杂的作用。本研究将为临床医师在早期判断预后及进一步制订个体化的免疫治疗方案提供帮助。