沉默TRIM26表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡、侵袭与迁移能力的影响

张 波，高 峡

宜昌市第二人民医院(三峡大学第二人民医院)肿瘤外一科 湖北宜昌 443000

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一[1]。在我国，乳腺癌是发病率与病死率均居第1位的女性肿瘤疾病[2]。TRIM是一类结构保守的蛋白家族，目前为止已发现80多个成员[3]。TRIM蛋白在先天性免疫反应、细胞增殖、分化、凋亡和自噬中均发挥重要作用[4-5]。此外，有研究[6]发现，TRIM家族蛋白与许多疾病密切相关，例如TRIM24、TRIM59、TRIM63等在胶质瘤、结直肠癌、肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤组织中高表达。关于TRIM26在部分肿瘤中发挥的作用已有研究[7]，但TRIM26在乳腺癌中的表达及机制尚不清楚。因此，本研究通过沉默乳腺癌细胞中TRIM26 的表达，观察乳腺癌细胞生物学行为的变化，并初步探究其作用机制，以期为乳腺癌的靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1标本、细胞及主要试剂乳腺组织标本为宜昌市第二人民医院2017年3月至2018年12月手术切除标本，癌及癌旁正常组织各50例。患者均为女性，年龄37～48(43.2±4.2)岁，乳腺癌的诊断依据 2003 年 WHO 乳腺癌病理分类标准，术前均未接受化疗、放疗等辅助治疗，均签署知情同意书，研究获得本院伦理委员会批准。人乳腺癌细胞株MCF-7 购自美国ATCC。胎牛血清、青霉素、链霉素、DMEM培养液以及胰蛋白酶购自美国 HyClone公司，Lipofectamine 2000试剂盒购自美国 Invitrogen 公司，Trizol 试剂盒与SYBR Green qPCR Master Mixes试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，结晶紫染色液、TRIM26免疫组化试剂盒、CCK-8试剂盒、Transwell小室与Annexin V-FITC试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白测定试剂盒与化学发光液ECL购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗TRIM26、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR以及mTOR均购自美国Santa Cruz公司，鼠抗GAPDH与HRP标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2乳腺癌与癌旁正常组织中TRIM26蛋白表达的免疫组化法检测将乳腺癌与癌旁正常组织用40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成4 μm厚的石蜡组织切片，经脱蜡处理后，采用0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液修复抗原，体积分数3% H2O2阻断内源性过氧化物酶后，牛血清白蛋白封闭30 min，加入TRIM26一抗(1∶500稀释)4 ℃孵育过夜，次日PBS 冲洗，加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀释)室温孵育30 min，PBS冲洗后DAB显色，苏木素复染，脱水透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察。应用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知乳腺癌组织阳性染色切片作为阳性对照。染色强度评分：无染色为0分，染色弱、呈浅黄色为1分，染色清晰、呈棕黄色为2分，染色强、呈棕褐色为3分。每例观察5个400倍视野，每个视野计数不少于200个细胞，阳性细胞百分比<10%为0分，10%～为1分，26%～为2分，51%～为3分，76%～为4分。两项评分之积≤1为阴性，≥2为阳性。

1.3乳腺癌与癌旁正常组织中TRIM26mRNA表达的qRT-PCR检测使用Trizol试剂盒分别提取乳腺癌与癌旁正常组织的总RNA，测定纯度和浓度，按照cDNA合成试剂盒说明进行反转录获得cDNA，使用SYBR Green qPCR Master Mixes试剂盒进行PCR，以GAPDH作为内参。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，TRIM26上游引物5’-TCCAGGCTGCAATCGCTA-3’，下游引物5’-ACTCCGTGACGATCCAGA-3’，产物大小为284 bp；GAPDH上游引物5’-TGAAGGTCGGAGTCAACG-3’, 下游引物5’-CATGTAGTTGAGGTCAATGAG-3’，产物大小为233 bp。扩增条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72℃ 10 s，35 个循环。采用2-ΔΔCt法计算TRIM26 mRNA的相对表达量。

1.4细胞培养、分组及siRNA转染将MCF-7 接种于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素与100 mg/L链霉素的 DMEM培养液中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中进行培养。待细胞融合度达到80%左右时，采用2.5 g/L胰蛋白酶进行消化传代。取对数生长期的细胞以 2×105个/孔接种于6孔板中进行培养，细胞融合度达到70%左右时进行转染。将细胞分为空白对照组(正常培养)、siRNA-NC组(转染阴性对照 siRNA-NC)和siRNA-TRIM26 组(转染 siRNA-TRIM26)，siRNA序列由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。按照Lipofectamine 2000说明书操作。转染后细胞在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育6 h，弃原培养基，更换为DMEM新鲜培养基培养。

1.5细胞活性的CCK-8法检测将转染后的3组MCF-7细胞以3×103个/孔的密度接种到96孔板中，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中继续培养。分别于24、48、72、96 h时每孔加10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，在酶标仪上于450 nm 处检测各孔吸光度(A)值。实验重复3次。

1.6细胞集落形成数目的检测将转染48 h后的3组MCF-7细胞以2×103个接种到培养皿中，并轻轻晃动使细胞分散均匀，随后置于37 ℃、体积分数5% CO2的细胞培养箱中培养14 d。当出现肉眼可见的细胞集落，PBS洗涤后，40 g/L多聚甲醛固定，结晶紫染色10 min，流水冲洗，干燥后在100倍镜下观察并计数细胞集落数目(将≥50个细胞聚集作为1个细胞集落)。实验重复3次。

1.7细胞凋亡与细胞周期的检测①细胞凋亡：将转染48 h后的3组MCF-7细胞用预冷的PBS洗涤，采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行检测。首先使用500 μL Binding Buffer重悬细胞，在悬浮液中加入5 μL Annexin V-FITC，接着加入10 μL PI，室温避光孵育30 min，随后立即采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。②细胞周期：将转染后的MCF-7细胞用预冷的PBS洗涤，并使用预冷的体积分数75%乙醇重悬细胞，在-20 ℃固定24 h，PBS再次洗涤并重悬细胞，每组取 450 μL 细胞悬液，加2 μL RNase后，37 ℃孵育 10 min，接着加500 μL PI，37 ℃避光孵育30 min，过300目筛网，采用流式细胞仪检测细胞周期。实验均重复3次。

1.8细胞侵袭与迁移能力的检测在Transwell 小室的上室加50 μL稀释的 Matrigel 胶，37 ℃放置40 min。将转染48 h后的3组MCF-7细胞调整为1×106个/mL，Transwell小室的上室每孔加入100 μL 细胞悬液，下室加入600 μL含体积分数10% 胎牛血清的DMEM培养液培养至细胞贴壁，换无血清培养液培养12 h，放入37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育12 h ，取出小室，弃培养液，用棉签擦去上室的细胞，以40 g/L多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色10 min，PBS洗涤，封片，在200倍镜下拍照并统计侵袭细胞数。迁移实验无铺Matrigel 胶步骤，其他操作与侵袭实验相同。实验均重复3次。

1.9细胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR及mTOR蛋白表达的Western blot检测使用RIPA裂解缓冲液提取转染48 h后3组MCF-7细胞的总蛋白，检测蛋白浓度。每个样本取30 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离后蛋白转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉液室温封闭2 h，加入兔抗p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT(1∶1 000稀释)及兔抗p-mTOR、mTOR(1∶2 000稀释)，以鼠抗GAPDH(1∶5 000稀释)作为内参，4 ℃孵育过夜，次日弃一抗，TBST洗涤，滴加HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗涤后，滴加ECL发光显影，凝胶成像系统中曝光，利用 Bio-Rad软件分析各条带灰度值。以目的条带与 GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.10统计学处理使用SPSS 22.0进行数据分析。乳腺癌与癌旁正常组织中TRIM26 mRNA相对表达量的比较采用配对资料的t检验，TRIM26蛋白阳性表达率的比较采用配对资料的χ2检验；3组细胞A值、集落形成数目、细胞周期、凋亡率、侵袭细胞数、迁移细胞数和细胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白相对表达量的比较均采用单因素方差分析和SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结论

2.1乳腺癌与癌旁正常组织中TRIM26表达的比较癌旁正常组织和乳腺癌组织中TRIM26 mRNA的相对表达量分别为(1.00±0.02)和(3.67±0.54)(t配对=20.786，P<0.001)。乳腺癌组织中TRIM26蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织，见图1与表1。

图1 癌旁正常组织(A)与乳腺癌组织(B)中TRIM26蛋白的表达(IHC,×400)

表1 乳腺癌与癌旁正常组织中TRIM26蛋白表达的比较例

2.23组MCF-7细胞A值与细胞集落形成数目的比较结果见图2与表2。转染24、48、72、96 h后，siRNA-TRIM26组MCF-7细胞A值均小于空白对照组和siRNA-NC 组；siRNA-TRIM26组MCF-7细胞集落形成数目小于空白对照组和siRNA-NC组。

表2 3组MCF-7细胞A值与集落形成数目的比较(n=3)

2.33组MCF-7细胞细胞周期比较siRNA-TRIM26组G0/G1期细胞比例较空白对照组和siRNA-NC组降低，而G2/M期细胞比例较空白对照组和siRNA-NC组增加，见表3。

A：空白对照组；B：siRNA-NC 组；C：siRNA-TRIM26组

表3 3组MCF-7细胞细胞周期比较(n=3) %

2.43组MCF-7细胞凋亡率、侵袭细胞数、迁移细胞数比较siRNA-TRIM26组MCF-7细胞凋亡率高于空白对照组和siRNA-NC组，侵袭细胞数与迁移细胞数低于空白对照组和siRNA-NC组，见表4。

表4 3组MCF-7细胞凋亡率、侵袭细胞数与迁移细胞数比较(n=3)

2.53组MCF-7细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达比较siRNA-TRIM26组细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白相对表达量较空白对照组和siRNA-NC 组降低，见图3与表5。

1:空白对照组；2:siRNA-NC 组；3:siRNA-TRIM26组

表5 3组MCF-7细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的比较(n=3)

3 讨论

乳腺癌的主要治疗方法包括手术切除、激素治疗、放疗和新辅助化疗等[3]。近年来，基因靶向治疗在肿瘤治疗领域表现出广阔的应用前景[8]。TRIM家族中许多成员在肿瘤中发挥促癌或抑癌作用。例如，TRIM44通过刺激TLR4激活AKT/mTOR信号通路诱导黑色素瘤进展[9]，TRIM29通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进大肠癌的上皮-间质转化与发展[10]。TRIM26作为TRIM超家族成员之一，已发现其在天然免疫反应中发挥重要作用[11]。此外，TRIM26同样参与肿瘤的生物学进程，如TRIM26在肝癌组织中表达下调，与肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力呈负相关，并促进细胞凋亡，发挥抑癌作用[12]。TRIM26 在胶质瘤组织中呈高表达，过表达TRIM26可促进胶质瘤细胞U87及U251的增殖[13]。本研究结果显示乳腺癌组织中TRIM26蛋白和mRNA表达水平较癌旁正常组织升高，提示TRIM26可能参与乳腺癌发生发展。

本研究还探讨了TRIM26对乳腺癌细胞生物学行为的影响，结果显示，沉默乳腺癌MCF-7细胞中TRIM26的表达后，细胞的增殖活性明显下降，细胞集落形成数目也明显减少，细胞被阻滞于G2/M期，侵袭与迁移能力明显下降，凋亡率升高。PI3K/AKT/mTOR信号通路与细胞周期、增殖及凋亡等行为密切相关。在多种恶性肿瘤组织中PI3K/Akt/mTOR 信号通路的异常激活可增强细胞活性，促进细胞生长和蛋白质合成，从而促进癌症的发展[14]。本研究发现，在乳腺癌细胞中沉默TRIM26表达后，细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平明显下降。因此，我们推测沉默TRIM26表达可阻碍PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而抑制乳腺癌的一些恶性生物学行为。

综上所述，沉默TRIM26表达可抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭与迁移能力，并诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关，提示TRIM26可能是乳腺癌诊治的有效靶点之一。