mTOR-S6K1-Gli1信号通路在小鼠慢性瘙痒中的作用

姜 洋，刘岳鹏，何学明，谈 笑

1)蚌埠医学院附属连云港市东方医院皮肤科 江苏连云港 222042 2)蚌埠医学院附属连云港市东方医院转化医学中心 江苏连云港 222042 3)蚌埠医学院附属连云港市东方医院老年医学科 江苏连云港 222042

长期、难以抑制的慢性瘙痒困扰了许多患者，并极大降低了患者的生活质量，甚至造成心理障碍[1]。目前为止，慢性瘙痒的研究[2]发现了两类主要的瘙痒介质及其神经信号通路(组胺信号通路和非组胺信号通路),且发现脊髓部位信号通路的变化对于慢性瘙痒的发生可能具有重要作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，脊髓和神经节mTOR及其信号通路被证实参与多种病理生理过程的调节，比如脊髓再生[3]、 周围神经再生[4]、神经病理性痛觉过敏[5]、吗啡耐受[6]等。有实验[7-9]证实胶质瘤相关癌基因同源蛋白-1(Gli1)是mTOR/核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)信号通路的下游蛋白；mTOR-S6K1-Gli1信号通路参与体内多个生理病理过程，特别是慢性疼痛。考虑到慢性瘙痒与慢性疼痛在神经传导过程中以及机制方面存在诸多相似性,本研究观察了慢性瘙痒模型小鼠皮肤及脊髓组织mTOR-S6K1-Gli1信号通路蛋白的变化，以探讨该信号通路是否参与慢性瘙痒的发生。

1 材料与方法

1.1材料雄性2月龄昆明小鼠，体重23～26 g，由南京医科大学实验动物中心提供。恶唑酮(美国Sigma公司)，Gli1抑制剂GANT61 (美国Selleck公司)，兔抗mTOR抗体、GAPDH单抗(美国CST公司)，兔抗S6K1抗体、兔抗Gli1抗体(英国Abcam 公司)，鼠抗兔抗体(美国Santa Cruz 公司)，DAB显色试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)，ECL检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)。Tanon-5200化学发光仪(上海天能公司)，冰冻切片机(德国Leica公司)。

1.2动物分组将40只小鼠分为5组：空白对照组、溶剂对照组、致痒组、致痒+抑制剂组和致痒+抑制剂溶剂组，每组8只。 动物模型的制备参照文献[10-11]介绍方法,将给药位置调整为小鼠腰背部。实验前2 d,小鼠腰背部备皮,以双侧髂嵴连线中点为中心，直径2 cm。实验当天记为第0 天，上午10点致痒组、致痒+抑制剂组及致痒+抑制剂溶剂组小鼠在备皮中心位置一次性涂抹16 g/L 恶唑酮溶液(乙醇为溶剂)15 μL致敏，空白对照组、溶剂对照组分别涂抹15 μL生理盐水和乙醇；第7、 9、12、14、16、19天上午10点,致痒组小鼠涂抹15 μL 8 g/L恶唑酮溶液进行激发，空白对照组、溶剂对照组小鼠分别给予15 μL的生理盐水、乙醇涂抹，致痒+抑制剂组、致痒+抑制剂溶剂组小鼠同致痒组激发外，致痒+抑制剂组在第14、15、16天上午9 点给予5 μL 40 g/L的GANT61溶液(以体积比为4∶1的玉米油和乙醇为溶剂)鞘内注射，致痒+抑制剂溶剂组则给予等体积抑制剂溶剂。

1.3行为学观察实验第0、7、9、12、14、16、19 天，局部涂药前先将小鼠放入15 cm×15 cm×15 cm的透明塑料盒中适应30 min取出涂药后放回盒中观察,不管小鼠连续舔或搔抓瘙痒部位多长时间均记为一次完整的搔抓动作,记录30 min内完成的舔或搔抓次数。

1.4皮肤组织病理学观察实验第19天,每组取3只小鼠，行七氟烷吸入麻醉后处死，取给药处皮肤组织,40 g/L甲醛固定后，常规石蜡包埋、切片，HE染色，镜下观察。

1.5脊髓组织Gli1蛋白表达的检测取1.4中小鼠脊髓腰膨大节段,加入裂解液,冰浴超声匀浆，15 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清液。蛋白样品与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液按4∶1混合，沸水中加热10 min。每个泳道加20 μg蛋白样品，SDS-PAGE后转PVDF膜，室温封闭60 min,加入按1∶2 000稀释的兔抗Gli1抗体,4 ℃过夜。TBST洗膜后再加辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔抗体室温孵育2 h。ECL法显色，应用Image J软件分析，以目的蛋白条带和内参GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量,最终结果均与空白对照组相比。

1.6脊髓组织mTOR、S6K1和Gli1蛋白表达的定位取溶剂对照组和致痒组小鼠各3只,行七氟烷吸入麻醉，给予40 g/L多聚甲醛心脏灌注，取脊髓腰膨大节段，置于40 g/L多聚甲醛中固定过夜，脱水后连续切片(厚度15 μm)。体积分数3%H2O2孵育10 min，分别加入按1∶100稀释的兔抗mTOR、S6K1和Gli1抗体,4 ℃过夜，加相应二抗室温孵育2 h,DAB显色、封片。显微镜采集图像。

1.7统计学处理应用SPSS 21.0处理数据。5组小鼠不同时间点搔抓次数的比较采用重复测量数据的方差分析,各组小鼠脊髓组织中Gli1蛋白表达的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验， 检验水准α=0.05。

2 结果

2.15组小鼠搔抓次数的比较与空白对照组和溶剂对照组比较，致痒组小鼠搔抓次数逐渐增加，并在第16天达高峰。致痒组与致痒+抑制剂组小鼠搔抓次数在第0～12天差异无统计学意义，但在第14、16、19天，致痒+抑制剂组小鼠搔抓次数少于致痒组(表1)。

2.25组小鼠皮肤组织病理学观察实验第19天,空白对照组、溶剂对照组小鼠皮肤组织未见明显炎症细胞浸润或皮肤改变；致痒组小鼠皮肤表皮组织可见细胞水肿,真皮及皮下组织尤其毛囊周围可见大量淋巴细胞、少许嗜酸性粒细胞浸润，结合表1结果，说明瘙痒模型成功建立。与致痒组比较，致痒+抑制剂组小鼠皮肤组织炎症细胞减少(图1)。

表1 5组小鼠搔抓次数的比较(n=8)

A、B、C、D、E：分别为空白对照组、溶剂对照组、致痒组、致痒+抑制剂组和致痒+抑制剂溶剂组

2.35组小鼠脊髓组织中Gli1蛋白的表达结果见图2。实验第19天，各组小鼠脊髓组织中Gli1蛋白的表达差异有统计学意义(F=128.902,P<0.001)；与溶剂对照组(1.034±0.039)相比，致痒组(2.519±0.096)和致痒+抑制剂溶剂组(2.302±0.077) Gli1蛋白的表达升高(P<0.05)，而致痒+抑制剂组(1.132 ±0.069)无明显变化(P>0.05)。

图2 各组小鼠脊髓组织中Gli1蛋白的表达

2.4溶剂对照组和致痒组小鼠脊髓组织mTOR、S6K1、Gli1蛋白的定位结果见图3。mTOR、S6K1、Gli1主要表达在致痒组小鼠脊髓背角浅层。

1：mTOR；2：S6K1；3：Gli1

3 讨论

本研究参照文献[10-11]建立小鼠慢性瘙痒模型，结果显示，与空白对照组和溶剂对照组比较，致痒组小鼠搔抓次数增加，结合实验第19天,致痒组小鼠皮肤表皮组织细胞水肿,真皮及皮下组织尤其毛囊周围可见大量淋巴细胞及少许嗜酸性粒细胞浸润,说明模型建立成功。

研究[2]表明，慢性瘙痒有两条神经信号通路：组胺信号通路和非组胺信号通路，且提示脊髓部位信号通路的变化与慢性瘙痒的发生有关。有研究[12]表明背根神经节部位的mTOR参与小鼠的慢性瘙痒过程。另外，有临床试验[13]表明mTOR抑制剂可以显著缓解骨髓纤维化患者的瘙痒症状，亦印证了mTOR相关信号通路与慢性瘙痒有关。此外，研究[14]表明慢性疼痛与慢性瘙痒有许多相似点并且共享相同的信号通路，比如二者都是由背根神经节或三叉神经节内的初级感觉神经元所传导；瞬时受体电位离子通道亚型V1和A1、Toll样受体和蛋白酶激活受体既参与介导疼痛也参与介导瘙痒。已有研究[9，15]表明mTOR-S6K1-Gli1参与慢性疼痛的发生和发展，因此推测该信号通路可能在慢性瘙痒过程中有一定的作用。mTOR-S6K1-Gli1信号通路被称作非经典的Hh信号通路。研究[16]表明Hh信号可以活化mTOR蛋白，进而影响下游的Gli1信号的稳定性。由于mTOR-S6K1-Gli1信号通路中其他因子在文献[12]中已有报道，该研究重点观察了Gli1在慢性瘙痒发生过程中的作用。结果显示，与溶剂对照组相比，致痒组小鼠脊髓组织Gli1蛋白的表达增加，而在瘙痒高峰期(第14、16、19天)给予Gli1蛋白的特异性抑制剂GANT61鞘内注射后，小鼠搔抓次数减少，说明Gli1可能参与瘙痒的发生。

此外，免疫组化结果显示mTOR、S6K1和Gli1蛋白在致痒组小鼠脊髓背角浅层表达，且表达强度高于溶剂对照组，提示三者可能共同参与慢性瘙痒的发生。

与文献[11]结果相比，本研究中慢性瘙痒模型小鼠的行为学变化趋势有所不同，推测是改变涂药部位和(或)皮肤对药物的敏感性不同导致小鼠搔抓行为的差异；另外，由于本实验所用恶唑酮的溶剂为乙醇，而文献所用溶剂为丙酮，丙酮本身对皮肤有较强的刺激作用，而乙醇相对温和，因此不排除溶剂差异引起瘙痒行为差异的可能。另外，本研究的不足之处：观察时间点的设计不够严谨，由于建立瘙痒动物模型实验的观察间隔常规取2或3 d,所以本研究未选取相同的时间间隔；另外，未进一步观察慢性瘙痒过程中mTOR、S6K1和Gli1的变化，后续研究中将加以改进。

综上所述，脊髓部位Hh非经典通路mTOR-S6K1-Gli1可能参与了慢性瘙痒的发生。