解淀粉芽孢杆菌1841的生物相容性和其发酵清液的理化性质测定

苏正川，熊仁科，吴红波，左建英，张 俊，景飞江

(四川龙蟒福生科技有限责任公司 营养生长素微生物发酵技术国家地方联合工程实验室，四川 眉山 620000)

【研究意义】解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens1841是四川龙蟒福生科技有限责任公司与四川大学、俄罗斯国家工业微生物保藏中心合作开发的生防菌株，在防治马铃薯真菌病害上具有潜力。目前已经可以工业化生产1000亿活芽孢/g的原粉，或将成为国内生物防治的一员。微生物制剂的市场广阔，具有良好的发展前景。据统计，2017年全球的农用微生物制剂的销售额约为30.9亿美元，预计到2022年将达到60.1亿美元[1]。制剂产品的开发是将解淀粉芽孢杆菌从实验室研究到田间应用的必经途径。且微生物杀菌剂为活体微生物，其产品开发要充分考虑微生物在制剂中和运输过程中的稳定性。只有解决了微生物的稳定性，才能保证产品的质量和使用中的效果。同时，农用微生物杀菌剂的防治效果不仅与生防菌的活菌数、活力及剂型种类、生产条件和贮存条件有关，跟田间使用时的环境条件也有很大关系，生防菌在田间环境中的定殖、生长很容易受到紫外光辐射、化学农药、水分、pH和营养状况等因素的影响。解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，属于根围促生菌，具有提高农作物产量、抑制植物病原菌和线虫生长的功能。它能够定殖在植物根系周围，产生表面活性素(Surfactin)[2]、杆菌霉素D (Bacillomycin D)[3]、泛革素(Fengycin)[4]、伊枯草菌素(Iturin)[5]、环状细菌素(Amylocyclicin)[6]等多种抗菌和诱导植物系统抗性的物质，对灰葡萄孢[7]、镰刀菌[8]、核盘菌[9]、丝核菌[10]、疮痂链霉菌[11]、劳尔氏菌[12]等病原菌有较强的抑制作用。可用于多种作物(如烟草、莴苣、柑橘、马铃薯和黄瓜)的病害防治[13-17]，具有良好的防治效果。同时，解淀粉芽孢杆菌可以产生赤霉素[18]、吲哚乙酸、细胞分裂素[19]、脱落酸[20]等多种生理活性物质和氨基酸类物质。解淀粉芽孢杆菌通过这些物质的合成来调控植物相关基因表达和调节根围土壤中其他生物的群落结构，来达到活化土壤养分、改善土壤理化特性、增加土壤肥力、拮抗病原物、降低植物病害、提高抗病性、促进作物生发育、增加作物产量和改善品质的作用。【前人研究进展】目前，很多解淀粉芽孢杆菌的菌株都有一定的生防活性，但是绝大多数没有应用到大田中。由于微生物农药自身的缺陷导致了目前的状况，因此，如何提高防效、是否能与其他农药混用、如何规避不良环境对其防效的影响是重要的研究内容。明亮[21]等筛选了解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂的配方，发现解淀粉芽孢杆菌与十二烷基硫酸钠等多种助剂具有良好的相容性，可作为制剂配方的备选助剂。谷春燕[22]等对解淀粉芽孢杆菌WH1G与氟啶胺复配进行了研究，发现其与氟啶胺具有较好的生物相容性，并且0.0454 mg/L氟啶胺与8.8126×106cfu/mL的WH1G体积比为4∶6时，毒性比率为1.412，表现为增效作用，田间防效高达69.79 %，显著高于单剂防效。解淀粉芽孢杆菌除了与许多助剂和杀菌剂表现出很好的相容性外，其发酵液也具有很好的稳定性，一般在80 ℃以下、pH 3.0～9.0、普通光和紫外线照射、蛋白酶等处理下，发酵液均具有很高的活性，只有部分特别极端条件对发酵液的活性有显著的影响[23-26]。研究还发现，不同的菌株之间，其对温度、pH等的敏感性也有差别。【本研究切入点】本试验研究了解淀粉芽孢杆菌发酵液的抑菌活性和抑菌谱；32种助剂、10种杀菌剂对解淀粉芽孢杆菌1841菌体的影响；以及温度、紫外线、pH和金属离子对解淀粉芽孢杆菌1841发酵液抑菌活性的影响。【拟解决的关键问题】通过解淀粉芽孢杆菌理化性质的测定，旨在为解淀粉芽孢杆菌1841的制剂产品开发、实际应用和货架贮藏提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌种 解淀粉芽孢杆菌1841、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、稻瘟病菌[Magnaporthegrisea(Hebert) Barrnov]、玉米灰斑病菌(Cerosporazeae-maydisTehon et Daniels)、马铃薯早疫病菌(Alternariasolani)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme Sheld)、尖镰孢菌(Fusariumoxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，由俄罗斯Gos NIIgenetika实验室提供；1000亿活芽孢/g解淀粉芽孢杆菌母粉，由四川龙蟒福生科技有限责任公司提供。

1.1.2 供试杀菌剂 60 %井冈霉素A原药、70 %春雷霉素原药、95 %噁霉灵原药、95 %吡唑醚菌酯原药、95 %嘧菌酯原药、97 %氟啶胺原药、96 %异菌脲原药、95 %咯菌腈原药、97 %烯酰吗啉原药、95 %氰霜唑原药，购买自成都联禾化工医药有限责任公司。

1.1.3 供试助剂 填料：膨润土、硅藻土、辅美粉、乳糖、葡萄糖、DT60；润湿分散剂： HDB-1903、HDB-382、HDB-D58、HDB-3800E(滁州德邦化工科技有限公司)，TERSPERSE 2020、TERWET 1004(亨斯迈化工贸易(上海)有限公司)，Morwet D500、Morwet EFW、Agrilan 700、TERGITOL W610、Dispwet WP-410(南京捷润科技有限公司)，LT-WP70、LT-9004(深圳市朗钛生物科技有限公司)，W-2001、W-2008(北京汉莫克化学技术有限公司)，木质素磺酸钠、K12(苏州市万能化工有限公司)，BG-150(西安高格生物科技有限公司)，K1200(威来惠南集团(中国)有限公司)。

1.1.4 供试培养基 PDA培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂 20.0 g，去离子水 1.0 L。

1.2 试验方法

1.2.1 解淀粉芽孢杆菌与助剂的相容性 参照明亮[21]等的方法，采用直接混合法，将不同的助剂与解淀粉芽孢杆菌母粉混合，同时不加助剂的解淀粉芽孢杆菌发酵液作为对照，在电热恒温干燥箱中(54±2)℃放置 14 d后测定，通过平板计数法进行活性测定，计算每克样品中生防菌 1841的含量，并做出安全性评价，选出对解淀粉芽孢杆菌活菌数没有影响的助剂，试验重复3次。

1.2.2 解淀粉芽孢杆菌与杀菌剂的相容性 采用含药平板法测定，设定井冈霉素、春雷霉素、噁霉灵、嘧菌酯、吡唑醚菌酯和氟啶胺的浓度为5000、1600、500、160、50 mg/L，异菌脲和咯菌腈的浓度为3000、960、300、96、30 mg/L，烯酰吗啉和氰霜唑的浓度为1000、500、250、125、62.5 mg/L，水溶性原药溶解到无菌蒸馏水中，水不溶原药溶解到丙酮中制成100 g/L的母液。将母液加入营养琼脂培养基中稀释成设定的浓度。

将解淀粉芽孢杆菌母粉用无菌蒸馏水稀释107倍，取100 μl加入到含不同浓度井冈霉素等杀菌剂的培养基中，待培养基凝固，放置在30℃恒温培养箱中培养16～18 h，统计解淀粉芽孢杆菌菌落数量，以加相同量的溶剂为对照。

抑制率(%)=(对照的菌落数量-处理的菌落数量)/对照的菌落数量×100

1.2.3 抑菌谱测定 采用生长速率法对解淀粉芽孢杆菌1841发酵清液抑菌范围进行研究，将供试的8种植物病原真菌在PDA平板上活化，待菌落布满培养皿的2/3时备用。取新鲜的发酵液用0.22 μl的针头过滤器过滤去除菌体，得到发酵清液，取10 mL加入到融化的90 mL PDA培养基中，混合均匀后倒入4个空培养皿中。待培养基冷却后接种供试菌株，以加发酵培养液的PDA为对照。于25℃黑暗培养若干天后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径。

1.2.4 发酵液对温度的敏感性 将解淀粉芽孢杆菌1841的发酵液通过过滤去除菌体，取7份，每份10 mL，分别在50、60、70、80、90、100和121 ℃条件下处理30 min，以未处理常温放置的发酵清液为对照，以核盘菌为指示菌进行抑菌试验，于25 ℃黑暗培养若干天后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算抑制率。

1.2.5 发酵液对紫外光的敏感性 将无菌发酵液的离心管编号，放在波长320～400 nm的紫外灯20 cm处，紫外线分别照射发酵液30、60、90、120、150和 180 min后，测定其对核盘菌的抑菌直径并计算抑菌率，每处理重复3次。对照是不经处理的无菌滤液，于25 ℃黑暗培养若干天后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算抑制率。

1.2.6 发酵液对酸碱度的敏感性 将菌株1841发酵清液装入10 mL离心管，用已经配好的1 mol/L 盐酸和 1 mol/L氢氧化钠分别调节各组pH，使各组pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，放置 24 h 后调回初始 pH (pH 7.4)，处理完成后，测定对核盘菌的抑菌直径并计算抑菌率，每处理重复3次。对照是不经处理的无菌滤液，于25 ℃黑暗培养若干天后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算抑制率。

1.2.7 发酵液对金属离子的敏感性 分别配制1 mol/L的硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化镁、氯化钠、氯化钾和氯化钙溶液，灭菌后放置备用，将解淀粉芽孢杆菌1841发酵清液取8份，每份10 mL，分别加入上述溶液100 μl，在25 ℃下温育24 h，以未处理的样品为对照，以核盘菌为指示菌试验，于25 ℃黑暗培养若干天后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算抑制率。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌1841的生物相容性测定

2.1.1 助剂对解淀粉芽孢杆菌1841菌活的影响 试验共测定了6种填料、11种润湿剂、8种分散剂以及7种其他助剂对解淀粉芽孢杆菌的影响。结果显示，解淀粉芽孢杆菌在填料硅藻土、膨润土和葡萄糖中的损失率分别为-2.48 %、-0.35 %和1.35 %，在其余填料中的损失率均大于10 %；解淀粉芽孢杆菌在润湿剂W-2001、W-610和LT-WP70中的损失率分别为7.74 %、8.75 % 和8.92 %，在其余润湿剂中的损失率均大于10 %；解淀粉芽孢杆菌在分散剂木质素磺酸钠中的损失率为7.09 %，在其余分散剂中的损失率均大于10 %；解淀粉芽孢杆菌在壳聚糖中的损失率为1.35 %，在其余其他助剂中的损失率均大于10 %(图1)。以上结果表明，解淀粉芽孢杆菌与硅藻土等3种填料、W-2001等3种润湿剂、木质素磺酸钠和壳聚糖的相容性较好，可作为解淀粉芽孢杆菌制剂配方的备选助剂，确保解淀粉芽孢杆菌具有更好的稳定性和更长的货架期。

硅藻土等6种物质为填料，W-2001等11种物质为润湿剂，木质素磺酸钠等8种物质为分散剂，壳聚糖等7种物质为其他助剂；不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著

2.1.2 杀菌剂对解淀粉芽孢杆菌1841菌活的影响 试验共测定了10种杀菌剂对解淀粉芽孢杆菌的影响。结果显示，解淀粉芽孢杆菌在氟啶胺和春雷霉素5个试验浓度下均不能活不能正常生长，其中氟啶胺抑制率为100 %；在噁霉灵、异菌脲、烯酰吗啉和氰霜唑较低浓度下(噁霉灵500 mg/L，异菌脲300 mg/L，烯酰吗啉和氰霜唑250 mg/L)菌体生长良好，抑制率均小于30 %；在井冈霉素、嘧菌酯、吡唑醚菌酯和咯菌腈5个浓度下均能良好生长，其中井冈霉素在5000 mg/L浓度下的抑制率也仅仅为23.7 %，其他3种杀菌剂在较低浓度下(嘧菌酯和吡唑醚菌酯500 mg/L，咯菌腈300 mg/L)抑制率较低，均在30 %以下(表1)。解淀粉芽孢杆菌与部分杀菌剂在较低浓度下具有较好的相容性。

表1 10种杀菌剂影响解淀粉芽孢杆菌试验结果

2.2 解淀粉芽孢杆菌1841发酵清液的性质

2.2.1 解淀粉芽孢杆菌1841发酵清液的抑菌活性 试验共测定了解淀粉芽孢杆菌清液对稻梨孢等8种植物病原菌的抑制活性。解淀粉芽孢杆菌清液对稻梨孢、核盘菌、灰霉菌、玉米尾孢和立枯丝核菌具有良好的抑制效果，抑制率均在80 %以上，对茄链隔孢、串珠镰刀菌和尖镰孢菌的抑制作用较低，最低只有41.3 %(表2)。解淀粉芽孢杆菌具有广谱的抑菌作用，具有应用到防治稻瘟病、菌核病、灰霉病、玉米灰斑病、立枯病和纹枯病等病害的潜力(图2)。

表2 解淀粉芽孢杆菌1841发酵清液的抑菌活性

图2 解淀粉芽孢杆菌1841发酵清液抑菌谱

2.2.2 温度对解淀粉芽孢杆菌发酵清液抑菌活性的影响 试验共测定了7个温度对解淀粉芽孢杆菌发酵清液抑菌活性的影响。结果显示，解淀粉芽孢杆菌发酵清液在50～80 ℃时对核盘菌的抑制率分别为80.62 %、81.25 %、80.78 %和80.06 %，与对照(80.78 %)无显著性差异；在90～121 ℃的抑制率分别为77.37 %、76.50 %和76.74 %，显著低于对照(图3)。结果表明解淀粉芽孢杆菌发酵清液的抑菌活性对温度不敏感，即使在121 ℃处理30 min后，其抑菌活性依然有原有活性的95 %。因此，解淀粉芽孢杆菌发酵清液具有很好的稳定性，能够适应较高的温度环境。

不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著，下同

2.2.3 紫外线对解淀粉芽孢杆菌发酵清液抑菌活性的影响 试验共测定了6个紫外线照射时间对解淀粉芽孢杆菌发酵清液抑菌活性的影响。结果显示，解淀粉芽孢杆菌发酵清液经紫外线处理30、60、90和150 min后的抑制率分别为97.26 %、96.67 %、96.58 %和96.92 %，与对照无显著性差异；处理120 和180 min后的抑制率分别为96.15 %和95.81 %，显著低于对照。结果表明，解淀粉芽孢杆菌发酵清液的抑菌活性对紫外线不敏感，即使在紫外线处理180 min后，其相对抑制活性依然有原有活性的98.85 %。因此，解淀粉芽孢杆菌发酵清液具有很好的稳定性，能够适应具有强紫外线的环境。

图4 不同紫外线照射时间处理试验结果

图5 不同pH处理试验结果

2.2.4 pH对解淀粉芽孢杆菌发酵清液抑菌活性的影响 试验共测定了10个pH对解淀粉芽孢杆菌发酵清液抑菌活性的影响。结果显示，其抑菌活性在pH3.0～12.0呈现先上升后降低的趋势，在pH5.0时，抑菌活性最高，其抑制率为89.82 %，在pH12.0时抑菌活性最低，其抑制率为58.37 %。在pH3.0～10.0范围内的抑菌活性与对照无显著性差异，在pH11.0～12.0范围内的抑菌活性显著低于对照。结果表明，解淀粉芽孢杆菌发酵清液的抑菌活性对pH的适应范围较广，即使在pH12.0处理24 h后，其抑菌活性也有原有活性的67.25 %。因此，解淀粉芽孢杆菌发酵清液具有很强的pH稳定性，可适应各种pH环境。

2.2.5 金属离子对解淀粉芽孢杆菌发酵清液抑菌活性的影响 试验共测定了8种常见金属离子对解淀粉芽孢杆菌发酵清液抑菌活性的影响。其抑菌活性经K+、Na+、Ca2+和Mg2+处理后的抑制率与对照相当，分别为91.02 %、92.19 %、94.25 %和93.09 %，与对照无显著性差异；经Cu2+、Fe2+、Zn2+和Mn2+处理后的抑制率有显著下降，分别为86.62 %、83.66 %、82.94 %和63.11 %，显著低于对照。解淀粉芽孢杆菌发酵清液与K+、Na+、Ca2+和Mg2+具有较好的相容性，而Cu2+、Fe2+、Zn2+和Mn2+会较大的影响其抑菌活性。

图6 8种常见金属离子处理试验结果

3 讨 论

国内外关于解淀粉芽孢杆菌的研究非常之多，其中，关于解淀粉芽孢杆菌FZB42的研究十分深入[27]，而解淀粉芽孢杆菌的产品却相对较少。在2017年国外新上市或新登记的解淀粉芽孢杆菌产品仅只有3个，菌株号分别为MBI600、D747以及一个新菌株。而国内也只有2个菌株(B7900和PQ21)取得了原药登记。由此可见，微生物农药的筛选是一个庞大的工程，从实验室到田间应用要经过漫长的过程。并且，即便是可以成熟应用，也受到制剂中助剂成分、混配成分以及使用、保存环境的影响。

本试验供试的解淀粉芽孢杆菌对稻梨孢、核盘菌、灰霉菌等植物病原菌具有很强的抑制作用，具有开发成微生物杀菌剂的潜力。解淀粉芽孢杆菌为活体微生物，要想将其开发成稳定的制剂成品，就必须考虑助剂对菌体的影响。本次试验测定了32种助剂对其的影响，部分助剂表现出了良好的相容性，如填料硅藻土和膨润土、润湿剂W-2001等、分散剂木质素磺酸钠等以及壳聚糖，这些助剂可作为开发微生物制剂产品的备选助剂。生物农药与化学农药不仅可以混用[28]，而且在一定范围内，具有协同增效作用。生物与化学的搭配不仅可以缓解生物农药药效慢、防效差的问题，同时，也可以减少化学农药的使用量。因此，本试验也测定了解淀粉芽孢杆菌与一些化学农药和微生物源农药的相容性。发现，大部分杀菌剂在中等浓度(100～1000 mg/L)或者低浓度(<100 mg/L)下，与解淀粉芽孢杆菌都具有良好的相容性，可是考虑田间混用，甚至可以开发生物-化学复配的农药产品。最后，微生物农药在发酵的过程中，会向发酵液中释放大量的抗生物质，是微生物农药产生防效的重要来源。在生产过程中通常会通过喷雾干燥等方法将代谢产物和菌体一起作为制成农药产品。本试验测定了温度、紫外线、pH和金属离子对发酵清液的影响，发现解淀粉芽孢杆菌1841的发酵清液在高温、紫外线照射、不同的pH环境和部分金属离子存在的环境中，均具有良好的抑菌活性，但是要避免与Cu2+、Fe2+、Zn2+和Mn2+的长时间接触。

本试验的结果为解淀粉芽孢杆菌1841的制剂产品开发、混用和使用以及保存提供了一定的理论基础。但存在很多的不足，在今后的试验中需要对更多的助剂、杀菌剂和病原菌进行试验。同时，还需要对其混配是否增效以及防效进行更深入研究。

4 结 论

解淀粉芽孢杆菌1841对稻梨孢、核盘菌等植物病原真菌具有很强的抑菌活性，具有广谱抑菌活性；硅藻土等助剂对其菌体保存无明显影响，表明其与多数助剂具有良好的生物相容性，在开发制剂产品时具有广泛的助剂可供选择；在部分杀菌剂田间使用浓度范围内，对解淀粉芽孢杆菌1841的生长无显著影响，表明其与部分杀菌剂可以混用；其发酵液对温度、pH、紫外线以及K+等金属离子具有良好的稳定性。这些研究结果为解淀粉芽孢杆菌1841制剂产品开发、混配使用和生物-化学复配杀菌剂以及贮存方式等提供了理论依据。