不同精粗比底物下添加亚硝酸钾对长期瘤胃体外发酵的影响

2020-08-04张世杰葛红帆

中国饲料 2020年13期

林淼，张世杰，葛红帆，张蒙，巩帅

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）

亚硝酸盐是瘤胃硝酸盐还原的中间产物，目前对亚硝酸盐的关注多集中在过量亚硝酸盐导致机体中毒（Cockburn等，2013）。但是确定亚硝酸盐对瘤胃发酵的影响及其调控因素具有重要的价值。Asanuma等（2015）报道，硝酸盐易在瘤胃内被还原为亚硝酸盐进而生成氨。Wang等（2018）研究表明，硝酸盐和亚硝酸盐可提高瘤胃微生物蛋白的合成量。但是，亚硝酸盐还原为氨比硝酸盐还原为亚硝酸盐需要更多的电子（Latham等，2016；Iwamoto 等，2001）。 Latham 等（2016）报道，氢（H+）是亚硝酸盐还原的必需电子供体，同时供氢体是日粮碳水化合物发酵的产物。丁健（2003）研究表明，日粮精粗比为8：2时，瘤胃微生物活性及发酵水平较高。同时，高精粗比改变了瘤胃体外发酵参数，显著提高了氨态氮的利用率（陈志龙等，2016；何玉鹏等，2014）。林淼等（2014）报道，NDF:NFC=0.71时，最有利于湖羊瘤胃还原硝酸盐。Sakthivel等（2012）研究表明，高精粗比可促进硝酸盐的还原。由于饲喂亚硝酸盐存在中毒风险，体外培养就成为研究亚硝酸盐瘤胃发酵的主要手段。然而，关于瘤胃体外长期培养的发酵模式是否发生变化的研究较少。同时，不同精粗比对亚硝酸盐的体外瘤胃发酵的影响鲜见报道。因此，本试验选用玉米和苜蓿为发酵底物配合成不同精粗比，研究其对长期体外传代培养的亚硝酸盐还原的影响，为探索调控亚硝酸盐瘤胃还原提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验设计采用双因素双水平试验设计，选取2头体况良好，安装永久性瘤胃瘘管的湖羊作为瘤胃液供体动物。动物的全混合日粮精粗比为6：4，饲粮组成为玉米20%，豆粕6%，玉米酒精糟7%，豆皮20%，燕麦草20%，大豆油1%，小苏打1%，预混料5%。饲粮粗蛋白质含量为14.12%，消化能为9.26 MJ/kg，中性洗涤纤维含量为30.14%。每天饲喂三次（07:30、14:30和20:30），自由饮水。晨饲后5 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物，经4层纱布过滤，迅速带回实验室进行体外培养。

1.2 体外发酵底物将玉米和苜蓿粉碎过1 mm筛，分装，广口瓶贮存备用。发酵底物组成如下：

LC：0.07 g玉米+0.21 g苜蓿；LC-N：0.07 g玉米+0.21 g苜蓿+亚硝酸钾（终浓度10 mmol/L）；HC：0.21 g玉米+0.07 g苜蓿；HC-N 底物：0.21 g玉米+0.07 g苜蓿+亚硝酸钾（终浓度10 mmol/L）。各设置3个平行。试验所用亚硝酸钾购自上海沪试。

1.3 体外培养方法称取底物，分别转移入厌氧瓶，加入15 mL培养液和2 mL的瘤胃发酵液，持续通无氧CO2，密封后记录初始气压，并放入39℃恒温培养箱中培养24 h，视为一代。在培养24 h之后，取出厌氧瓶，记录末气压；开盖吸取2 mL培养液，传代入新鲜培养基中，密封记录下一代的初期气压，放入39℃恒温培养箱中培养24 h。整个接种和传代过程，必须保证厌氧。

每次传代前测定发酵液pH，并每培养30代采集一次样本，备测NO2-、NH3-N及TVFA浓度。30代结束后玉米苜蓿比例由1:3更换为3:1，即用底物HC替换底物LC，用底物HC-N替换底物LC-N，继续培养至第30代结束；测定指标同上。

1.4 样品的采集与分析在培养的相应代次采集2 mL发酵液，置于-20℃保存备测。样本液解冻后离心（12000 r/min，20 min），保留上清液，按照1:5的比例加入25%的偏磷酸，冷冻过夜；再取出解冻后离心（12000 r/min，20 min）。将此去蛋白后的上清液分成三份，分别用于测定NO2-、NH3-N和VFA的含量。NO2-浓度采用比色法（南京建成生物工程研究所试剂盒）；NH3-N浓度采用酚-次氯酸钠比色法（Broderick 等，1980）；VFA浓度采用日本岛津GC-14B气相色谱仪测定（林淼等，2010）。

1.5 统计分析产气量按以下公式计算：

V x=Vj×Ppsi×0.068004084；

式中：Vx为39℃时的产气量，mL；Vj为发酵瓶内气体的体积，mL；Ppsi为一定时刻发酵瓶内的气压，psi。

试验数据采用SAS 9.2统计软件中的MIXED进行方差分析，以Tukey做两两比较，结果以“平均值”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 长期培养的体外发酵产气量和pH变化规律不同玉米：苜蓿比例各培养30代的产气量和发酵液pH见图1。在培养30代后，两个精粗比的体外产气量和pH均达到稳定，且标准误减少。添加亚硝酸钾降低了发酵产气量，升高了发酵液pH。

2.2 不同精粗比条件下添加亚硝酸钾对发酵参数的影响由表1可知，LC-N组产气量显著低于LC组和LC-N组（P＜0.01），LC组和HC组体外产气量无显著差异；亚硝酸钾和玉米苜蓿比例间存在交互作用。发酵液pH的变化规律为LC-N组＞LC组＞HC组＞HC-N组（P＜0.01）。各组发酵液NO2-浓度均无显著差异（P＞0.05）。发酵液NH3-N浓度变化规律为LC-N组＞HC-N组＞LC组＞HC组（P＜0.01）；亚硝酸钾和玉米苜蓿比例间存在交互作用。发酵液TVFA产量以LC组和HC组最高，HC-N组次之，LC-N最低（P＜0.01）。此外，LC组的乙酸比例显著高于其他各组，而丙酸比例显著低于其他各组（P＜0.01）；丁酸比例各组间无显著差异（P＞0.05）。

表1 不同玉米∶苜蓿比例下添加亚硝酸钾对体外发酵参数的影响

3 讨论

3.1 长期培养的体外发酵产气量和pH变化规律 Martinez等（2010）报道，与饲喂相同饲料的瘤胃液供体羊相比，体外发酵16 d后，自动核糖体基因间隔分析（ARISA）结果表明，未检测到特异性细菌群落的变化；而Zapletalova等（2016）证明了利用双外流连续培养技术，在接种瘤胃内容物10 d内，发酵液SCFA产量和pH与瘤胃内相似，但瘤胃细菌群落结构发生了变化，并且此变化归因于该生物反应器中氧化还原电位的下降。出现不同结果的原因可能是选用了不同的发酵底物和培养模式。本试验以玉米和苜蓿为发酵底物，采用每日传代的方式实现30 d的连续培养，通过检测产气量和发酵液pH发现，体外产气量和pH在传代至20代之后趋于稳定，说明本试验培养30代时的数据较合理，可用于发酵参数的比较分析。

3.2 不同精粗比条件下添加亚硝酸钾对发酵参数的影响日粮精粗比对瘤胃内环境、瘤胃发酵水平和微生物活性及区系都有一定的影响。本试验主要对发酵液的产气量、pH及NO2-、NH3-N、VFA浓度五个指标进行了测定和比较。目前对亚硝酸盐的研究多集中在病理学方面，鲜有关于直接添加亚硝酸盐对瘤胃发酵影响的报道。不同精粗比条件下发酵液中的NO2-24 h浓度无显著变化，说明精粗比不影响亚硝酸盐的体外还原。Lin等（2013）体外选用 2：8 和 8：2 的精粗比，添加硝酸盐后发现体外产气量显著降低，这与本试验精粗比为1：3的产气量规律相同。但本试验随着玉米比例的升高，亚硝酸钾对体外产气量无显著影响，该结果与前人研究结果不同。

无论是否添加亚硝酸钾，本试验精粗比为1：3的pH显著高于精粗比为3：1，这与杨靖等（2019）研究结果一致。本试验中精粗比为1：3底物添加亚硝酸钾显著提高了发酵液pH，这与前人研究结果一致。Zhao等（2015）选用精粗比为3：7的肉牛日粮中添加硝酸盐发现瘤胃pH升高。陈志远等（2016）选用精粗比为6：4的日粮研究湖羊日粮中添加硝酸盐后瘤胃发酵的变化，结果表明pH显著升高。Wang等（2018）在精粗比为5：5的奶牛日粮中添加硝酸盐发现瘤胃pH显著升高。相反的是，本试验发现精粗比3：1底物添加亚硝酸钾显著降低了发酵液pH，该结果与前人研究结果不同。

本试验添加亚硝酸钾显著提高发酵液的NH3-N含量，这与前人研究结果一致（陈志远等，2016；Zhao 等，2015；Lin 等，2013），表明亚硝酸钾可作为瘤胃细菌有效的非蛋白氮来源。而无论是否添加亚硝酸钾，NH3-N含量随玉米比例的升高而下降。有研究表明，山羊日粮精粗比为8：2时，细菌15N的富集量最高（赵国琦等，2004）。类似的研究在犊牛上表明，精粗比为6：4的日粮氨态氮浓度显著高于精粗比为5：5时（邹新平等，2015）。推测快速发酵碳水化合物含量高时，可提高氨态氮的利用效率。

本试验中，当精粗比由1:3提高为3:1后，乙酸含量下降，丙酸含量升高。梁静等（2016）的体外培养结果选用了精粗比为 3：7、4：6、5：5、6：4 和7：3，得出与本试验相似的结果。当日粮中精料比例增加时，乙酸浓度显著降低，丙酸浓度显著升高（Zhao等，2015）。高精料日粮中可发酵碳水化合物含量较多时，丙酸产量提高，发生的是丙酸发酵（丁健，2003）。因此，试验中当增加了玉米用量后，丙酸产量随之上升。当精粗比1∶3时添加亚硝酸钾TVFA产量显著降低，乙酸比例降低，丙酸比例升高；但选用发酵底物精粗比3∶1时，添加亚硝酸钾不改变体外产气量、TVFA产量、乙酸和丙酸比例，这说明亚硝酸钾改变了瘤胃发酵类型。